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  2. 產品課堂

    雷霆收罷江海凝 —— 試析近垂直轉子在超速離心中的應用-上

           Beckman二戰后到上世紀80年代,大批有影響力的超速離心技術理論專著出版發行。如1959 年,生物化學家 Howard K. Schachman教科書式著述《生物化學中的超速離心》出版。1962 年,Hiroshi Fujita用《沉降分析數學理論》系統闡述了超速離心實驗中擴散綜合效應、溶質沉降系數濃度依賴性和沉降邊界形狀的數學理論,隨后1975 年他的《超速離心分析基礎》一書問世。此外, Steensgaard. J 等的《生物化學的方法學發展》,C.A. Price 的《密度梯度離心》和B.D. Hames的《密度梯度離心條件的選擇》等著述涌現,可視為超離技術理論體系構建完成并日臻完善的標志。

            同時,超速離心方法的開發應用也取得了長足進步。1951年Myro Kendall Brake提出了速度-區帶密度離心方法(rate-zonal centrifugation)。1959年,Matthew Meselson和Christian de Duve等成功開發等密度梯度離心法(Isopyonic centrifugation)。Matthew Meselson還與 Franklin Stahl使用高濃度CsCl溶液超速離心實驗中成功分離DNA樣品。超速離心理論的引領和新方法的應用,推動生命科學研究領域里程碑式重大發現的井噴。借助超速離心技術,業界陸續發現了線粒體和核糖體(蔗糖密度梯度離心法)和溶酶體等細胞器,建立了噬菌體遺傳物質是DNA、 DNA半保留復制和DNA復制中的岡崎片段等關鍵基礎理論。
           當超速離心機的定角轉頭和水平轉頭已成功應用近半個世紀后,近垂直轉頭(Near-Vertical Rotor, NVT)終于在1989年姍姍來遲。比起甩平轉頭已沉淀的海量應用底蘊,錯失科學大發現風口的NVT轉頭,是實實在在的“輸在起跑線上”。
           超離用的NVT轉頭有何獨特性能優勢,Beckman等超離巨頭推出NVT初衷是什么,而NVT對使用者而言到底有何特殊價值?這些問題正是本文嘗試探討的主題。
           NVT近垂直轉頭是充分融合定角轉頭(20°- 45°)和垂直轉頭(Vertical Rotor, VT)兩二者屬性特點而開發的一種較新型轉頭。從剖面上看,轉頭的離心孔、轉軸的中線間有一7.5°– 8.5°的夾角,本質上它屬于定角轉頭。但其角度明顯小于定角轉頭的20° - 45°角,而與垂直轉頭的0°角極近,故命名為近垂直轉頭。                                              

    Beckman Optima XPN-100_Optima XPN-90_Optima XPN-80超速離心機NVT 90近垂直轉頭.jpg

          NVT既有垂直轉頭樣品容量大、可承受的梯度介質密度高(可達1.7g/ml)、轉速高(Optima XE-100、Optima XPN-100系列超速離心機近垂直轉頭NVT100可承受100000rpm)、樣品沉降路徑短、分離速度快(離心時間比垂直轉頭稍長,但比定角轉頭、甩平轉頭都短)的優勢,又因有固定傾角,被沉淀組分可沿離心管外側管壁滑向管底部并沉積成團(pelleting)。特定組分通過沉淀與其它可溶性成份分離后,收集沉淀十分方便。而在質粒純化肘,NVT轉頭可將RNA在梯度介質下層管底形成沉淀,避免RNA了與質粒DNA樣品帶接觸,防止污染。
           理論上,NVT轉頭可用于膜蛋白質等生物大分子和細胞器的差速離心(Differential centrifugation)沉淀、速度-區帶離心(Rate zonal centrifugation),還可承擔平衡密度梯度離心(equilibrium density gradient centrifugation)或等密度離心(Isopycnic centrifugation)任務。
           阿拉斯加科技(北京)有限公司應用支持小組,在2023年6月份,組織實施了一項對Beckman超速離心機轉頭在科研實驗中應用情況的分類調研計劃。調研的結果從本篇開始陸續刊載。


    1、Beckman NVT轉頭在生物樣品超速離心的實際使用概況

           調研對象:Beckman NVT 100、NVT 90、NVT 65和NVT 65.2四個近垂直轉頭

           調研內容:NVT離心分離的具體對象和使用方法

           資料來源:截止至2023.06.30 PubMed期刊在線數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)已收錄的、使用了上述四個轉頭中任何一個進行樣品超速離心處理的公開實驗論文。

    表1.  Beckman NVT系列轉頭文獻使用頻次統計

    Rotor Model

    Specifications

    Search details

    Items

    Sum

    NVT 100

    8×5.1 mL

    100000 rpm

    NVT-100 [Text   Word] AND Beckman [Text Word]

    5

    10

    NVT100 [Text   Word] AND Beckman [Text Word]

    5

    NVT 90

    8×5.1 mL

    90000 rpm

    NVT-90 [Text   Word] AND Beckman[Text Word]

    12

    59

    NVT90 [Text   Word] AND Beckman [Text Word]

    47

    NVT 65

    8×13.5 mL

    65000 rpm

    NVT-65 [Text   Word] AND Beckman [Text Word]

    3

    61

    NVT65 [Text   Word] AND Beckman [Text Word]

    58

    NVT 65.2

    16×5.1 mL

    65000 rpm

    NVT-65.2   [Text Word] AND Beckman [Text Word]

    3

    17

    NVT65.2 [Text   Word] AND Beckman [Text Word]

    14

    Total PMC Full-Text Search Results

    147

           表1顯示,Beckman超速離心機配套的4個近垂直轉頭中,論文中出現次數最多的是NVT 65和NVT 90。

           根據SCI期刊影響因子查詢網站(http://sci.justscience.cn)各期刊2023年的IFoid分值數據,先剔除無IFoid分值或分值≤4.000的刊文;再將文中轉頭信息明顯有誤的記錄舍棄,最后把屬于同一研究小組發表在不同年份不同、但超離部分實驗采用完全相同離心參數條件的多篇論文視作1篇統計處理后,剩余79篇刊文。

           逐篇文章梳理復核后,按離心實驗樣品的類型逐一歸類統計,結果見下圖1。

    Optima XPN-100_Optima XPN-90_Optima XPN-80超速離心機NVT 100_NVT 90_NVT 65_NVT 65.2近垂直轉頭實驗報道刊文數統計圖.jpg

           統計結果顯示,近垂直轉頭適用的對象涵蓋了蛋白、核酸、病毒、細胞器和脂肪酸等五大類生物組分。NVT的應用案例有限,卻亮點紛呈。

    1.1 病毒類樣品分離

           Beckman NVT系列超速離心機轉頭用于病毒類樣品分離純化主要是三個用途。一是從轉染了重組腺相關病毒載體(recombinant adeno-associated virus vectors, rAAV vectors)的細胞中分離載體病毒,評估驗證病毒表達和滴度。二是將外源靶基因整合于病毒載體經細胞表達后制備收集疫苗類蛋白。三是構建病毒特定編碼基因的突變體,分離轉染細胞的表達產物,以了解病毒結構蛋白或特定功能蛋白復合體的組裝機制。

           資料顯示,與NVT轉頭有關的病毒類應用中,報道最多的(rAAV vector,其次是噬菌體(phage)和病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs)。

           CRISPR/Cas9是目前基因組編輯操作最流行的工具。而腺病毒相關載體以其體內低免疫原性、非致病性、穩定長效表達和一定程度的組織選擇性,被視為最有前景的基因轉導載體。由此吸引了人們將CRISPR-Cas9與AAVs一起部署開發新型AAV-CRISPR-Cas9載體平臺,以期安全有效地用于基因組編輯、轉錄調控和拓展改進rAAV的應用。哈佛大學研究人員對修飾小鼠遺傳缺陷的治療工具載體AAV-Cas9-gRNA的病毒生物分布、各種器官的編輯效率、抗原性、免疫反應和生理反應等進行了評估。結果表明,AAV-Cas9-gRNA在小鼠體內可有效激活宿主免疫,未出現其它載體工具中常見的細胞損傷現象。對rAAV載體的純化,使用了Optiprep(主要成分是碘克沙醇odixanol)密度梯度介質的離心方法。將含AAV的細胞裂解上清液,經50 kDa MWCO超濾和濃縮處理,加載到由15%,25%,40%,60%各2ml組成的不連續密度梯度液頂部。使用NVT65轉子58000rpm、18℃離心1.5小時后,收集位于40% - 60%梯度界面處的AAV條帶進行下一步分析測定。

    Beckman Optima XPN-100_Optima XPN-90_Optima XPN-80超速離心機NVT 65近垂直轉頭不連續密度梯度離心設置演示圖.jpg

           噬菌體(Bacteriophage)是一種專門感染細菌、真菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒,分為毒性噬菌體(virulent phage)和溫和噬菌體(temperate phage)兩類。

           毒性噬菌體感染宿主后,會利用細菌胞體內的原料合成核酸和蛋白質裝配成成熟的子代噬菌體,并最終裂解宿主菌體,釋放出子代噬菌體繼續下一步感染。溫合噬菌體感染細菌,只將自身基因整合到細菌染色體上(自身其余結構組件溶解),但不引起細菌裂解。這種整合在細菌基因組上的外來噬菌體基因稱為原噬菌體/前噬菌體(prophage)。原噬菌體可隨細菌染色體的復制而復制,并通過細菌的分裂將原噬菌體傳給下一代細菌。當有低劑量紫外線照射,或其他物理、化學方法等誘導因素作用時,前噬菌體可被激活,自我復制并產生大量新的成熟噬菌體,裂解宿主胞體并釋放出噬菌體粒子。溫和噬菌體這種產生成熟噬菌體和溶解宿主菌的潛力,稱為溶原性( lysogeny)。

           在漫長的進化機制驅動下,細菌與噬菌體間演變為一定程度的相生相克、互利互惠關系。一方面細菌通過CRISPR-Cas系統機制對抗毒性噬菌體感染。另一方面,細菌明修棧道暗度陳倉,在受輔助噬菌體(屬溫活噬菌體)感染后,細菌蛋白編碼基因激活,與噬菌體的支架蛋白(scaffolding protein, SP) 競爭衣殼蛋白 (capsid protein, CP) 結合位點而改裝噬菌體衣殼蛋白內部空間構象。改裝后的噬菌體衣殼蛋白,無法容納噬菌體整個基因組,只能進行細菌特定基因片段的包裝。借此貍貓換太子的神操作,宿主菌利用輔助噬菌體的病毒組裝機制產生大量具有感染活性的假噬菌體顆粒。最終,隨著宿主菌體裂解,攜帶有宿主菌基因的假噬菌體釋放并感染新宿主菌,細菌特定基因得以在菌體群落中保留與潛行。

           金黃色葡萄球菌的大多數毒力因子編碼在前噬菌體、質粒和基因組島等可移動基因元件(mobilegenetic elements,MGEs)上。金黃色葡萄球菌致病島(Staphylococcus aureus pathogenic island,SaPI)是一個編碼包括毒素、粘附素、凝血因子和免疫調節因子等一系列毒力因子的龐大基因組島家族,屬典型的噬菌體誘導性染色體島(Phage-Inducible Chromosomal Islands,PICIs)。在無輔助噬菌體感染時,SaPI表達被抑制子抑制而處于前噬菌體狀態。在輔助噬菌體感染并處于溶菌周期時,噬菌體表達一種去阻遏蛋白幫助SaPI從宿主染色體上切除、復制并表達。其表達產物可通過調節輔助噬菌體衣殼的裝配,使SaPI基因被優先包裝防止形成成熟的噬菌體顆粒。噬菌體轉導的MGEs水平轉移( horizontal gene transfer)導致新的毒素基因產生、不同菌株基因組間的差異以及高致病性菌株的產生,在細菌基因組進化和適應環境壓力中發揮重要作用,引起了學界廣泛關注。

           溫合噬菌體80α是感染金黃色葡萄球菌和其他革蘭氏陽性細菌的輔助噬菌體的代表,是包括SaPI1,SaPI2和SaPIbov1在內多種SaPI移動遺傳元件高頻動員的輔助者。80α具有直徑為63 nm的T = 7二十面體衣殼和190 nm長的彎曲尾部。80α衣殼蛋白(CP,324個殘基)首先組裝成一個空的前衣殼(procapsid),需支架蛋白(SP,206個殘基)作為組裝伴侶。SaPI1通過編碼的CpmB蛋白,與80α衣殼蛋白結合,將噬菌體80α衣殼打造成了SaPI1基因組的私人定制包裝。

    Optima XPN-100_Optima XPN-90_Optima XPN-80超速離心機NVT 90近垂直轉頭用于噬菌體衣殼蛋白分離實驗.jpg

           美國國立衛生研究院國家關節炎-肌肉骨骼和皮膚病研究所的研究小組采用了2-3步超速離心的方法分離純化2株金黃色葡萄球菌的蛋白組分,用于Western Blot檢測和前衣殼蛋白的電子顯微鏡結構分析。實驗中蛋白樣品制備流程簡述如下:

           1)用絲裂霉素誘導金黃色葡萄球菌80α溶原菌株誘導表達產生噬菌體80α前衣殼procapsids;

           2)裂解菌體后,7000g離心20 min去除菌體碎片;

           3)上清中可溶性蛋白,用10% PEG 8000(w / v)和0.5M NaCl重懸后,7000g離心20分鐘,收集沉淀;

           4)將沉淀重懸于噬菌體緩沖液中,上樣覆蓋于濃度1.42 g/cm3的CsCl溶液層上,用Beckman NVT90轉子15℃ 70000rpm離心20小時。 用針頭收集含有前衣殼的條帶,用噬菌體透析緩沖液(25 mM Tris-HCl pH 7.8,50 mM NaCl,1 mM MgSO4和4 mM CaCl 2)透析處理除去樣品中的CsCl;

           5)初步純化的噬菌體蛋白組分在10–40%(w / v)蔗糖連續梯度液中用SW41轉子4℃ 30000rpm離心2小時,將前衣殼與噬菌體尾巴分離。收集純化后的前衣殼條,一部分用于SDS-PAGE實驗鑒定,其余部分用于下一步的操作;

           6)經蔗糖梯度純化后的樣品用透析緩沖液稀釋后,在70Ti轉子中50000rpm 4℃下1小時離心后,將沉淀重懸于噬菌體透析緩沖液中。制備衣殼蛋白的電子顯微鏡分析樣品。

           病毒樣顆粒(virus-like particles, VLPs)具有與病毒顆粒類似的結構,但不含復制酶和編碼病毒結構蛋白的核酸,缺乏復制能力。大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞和植物等多種表達體系可表達VLPs。諾瓦克病毒(Norwalk virus, NV)是一種可造成人類急性胃腸炎流行性暴發的單鏈RNA病毒。其衣殼由主要結構蛋白的多個拷貝構成,決定著病毒結構完整性、免疫原性和感染性。衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達后可自組裝產生在形態和抗原上與天然NV顆粒十分相似的NV病毒樣顆粒。

           為鑒定參與組裝NV衣殼蛋白功能結構域,研究人員構建了10個衣殼蛋白的缺失突變體用VLP作為載體轉染昆蟲細胞。將細胞裂解液添加至30%初始濃度的碘克沙醇溶液頂部,通過離心形成自生成等滲密度梯度,用NVT-65.2轉子中63000rpm離心3小時后,收集蛋白條帶,經進一步純化后用于昆蟲細胞表達的可溶性蛋白質的結構分析和Western Blot檢測。

     

    1.2 質粒/核酸純化

           Beckman 超速離心機NVT系列轉頭用于核酸分離純化應用的報道,除了常規組織/細胞/微生物DNA(如HSP90基因、線粒體DNA(mtDNA)、工程菌體質粒DNA純化(如pUC:HSP90rr環狀質粒)和RNA/Poly(A+) RNA分離外,還有環境微生物研究中關于DNA穩定同位素核酸探針檢測(Stable isotope probing of DNA, 13C-DNA-SIP)、RNA穩定同位素探針檢測 (Stable isotope probing of RNA, RNA -SIP)等應用。

    (待續:試析近垂直轉子在超速離心中的應用-中)

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