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  2. 產品課堂

    雷霆收罷江海凝 —— 試析近垂直轉子在超速離心中的應用-中

    (續:試析近垂直轉子在超速離心中的應用-上) 

    1.3 蛋白組分分離

           NVT轉頭分離處理的蛋白樣品類型繁多。若以細胞膜為界從空間上劃分的話,有膜外來源的藥物組分(如蜂毒素),有定位于細胞膜上的膜蛋白、激素和藥物受體(如AChRs、雄激素受體)、LDL/HDL脂蛋白、蛋白脂質體(proteoliposome)、脂筏(lipid rafts)和菌體的胞膜成份,定位于胞內的Pak1-βPIX -GIT復合物、可溶性胞質蛋白(如淀粉樣蛋白-β蛋白前體,AβPP),定位于細胞器質膜上的蛋白-RNA信號識別復合體SRP以及定位細胞核內的TOP1-DNA共價復合物、DNA復制轉錄有關的聚合酶β等酶類等。

           各種蛋白有不同的定位,如膜蛋白、胞漿蛋白、核蛋白、分泌蛋白及各種細胞器蛋白。蛋白的運輸與加工定位信號肽(signal peptide)/信號序列(signal sequence)引導。識別和結合信號肽的為一種核糖核蛋白復合物,稱為信號識別顆粒(signal recognition particle,SRP)。當SRP與新出現的信號肽結合時,它會誘導翻譯延伸暫停并引導翻譯復合體與內質網(ER)上的SRP受體結合。新生肽鏈通過SRP-ER連接的通道進入ER,被信號肽酶(signal peptides)切除。當內質網將信號肽切除后,蛋白翻譯才能繼續進行,并進行蛋白的折疊和修飾。

    Beckman Optima XE-100 Optima XE-90超速離心機NVT 65近垂直轉頭用于微生物SPR復合物組裝機制研究.jpg

           真核生物的SRP由一個7S RNA及6個與RNA結合的蛋白質亞基組成。這六個蛋白分別命名為SRP9、14、19、54、68和72。目前已知的是,SRP9/14異二聚體用于在SRP54亞基與新生多肽鏈新信號序列相互作用時阻止蛋白質翻譯。SRP19則促進SRP54與SRP RNA的附著。古菌SRP包含有7S RNA和兩個SRP19和SRP54蛋白組分。 

           將嗜鹽古菌(Haloferax volcanii)的SRP RNA,SRP19和SRP54三種純化蛋白在37℃高鹽溶液環境下單獨或一起孵育重建SRP復合物。通過NVT轉頭蔗糖密度梯度離心與凝膠電泳相結合的方法,檢查不同梯度離心條帶中的各種復合物,以解古菌SRP復合物結構的組裝機制。

           將孵育樣品上樣到在 50 mM MgSO4、5 mM DTT、50 mM Tris–HCl、50 mM Tris–HCl(pH 7.2)中制備的 40% - 10% 蔗糖梯度液頂部,用Beckman NVT65轉子55000rpm、4℃離心4.5小時后。通過SDS–PAGE分析所收集的18個組分中的蛋白質、用2%瓊脂糖凝膠電泳分析條帶中的RNA。通過凝膠密度掃描確定每個條帶組分蛋白(考馬斯藍標記)或RNA(溴化乙錠染色)的含量。

           實驗結果表明,在1M KCl中制備的蔗糖梯度條帶中,SRP19與SRP RNA的相互作用有限,但SRP54存在則可增強二者的結合。沒有SRP19時,H.volcanii SRP54可與SRP RNA相互作用并在梯度離心中定位于同一條帶。當SRP19存在時所有SRP54都可作為RNA-SRP19-SRP54三聚體復合物的一部分被檢測到,且在SRP RNA-SRP54復合物中可以檢測到大量SRP19。表明SRP19在古菌核糖核蛋白復合物中可能處于發揮增強SRP54結合的作用。提示SRP54與SRP RNA結合則很可能是SRP完全組裝不可缺少的部分。

           DNA拓撲異構酶(topoisomerase, TOPs)因其拓撲異構酶抑制劑類(TOP1-ADC)抗腫瘤藥物作用靶點身份而備受關注?;蚪M突變后錯誤的核糖核苷酸可以通過TOP1去除。但通過TOP1修復機制容易出錯,并導致Top1-DNA共價復合物(Top1-DNA covalent complexes, Top1cc)形成。而DNA修復的缺陷會導致DNA損傷的積累,隨之而來DNA損傷依賴性信號的傳導是許多人類神經發育/神經炎癥性疾病的神經變性的核心特征。

           核糖核酸酶H2((Ribonuclease H2,RNASEH2)是一種基因組監視因子,可從DNA中去除錯誤結合的核糖核苷酸(稱為核糖核苷酸切除修復)及R-環處理,對保持DNA 完整性至關重要。RNASEH2為包含有催化亞基RNASEH-2A、輔助亞基RNASEH-2B和RNASEH-2C亞基的異源三聚體復合物。其中RNASEH2B亞基介導了RNASEH2復合物和增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)之間的相互作用,將RNASEH2B定位于復制病灶。RNASEH2B失活后,DNA復制中會頻繁發生DNA雙鏈斷裂(double-strand break, DSB)且難以有效修復。

           Aicardi-Goutières綜合征(AGS)被認為與核酸代謝有關的基因突變發生有關。其中,RNASEH2突變占AGS病例的50%以上。動物實驗中,神經RNASEH2B失活的小鼠模型表現出小腦萎縮,白質缺陷和神經炎癥的AGS典型病變。Top1cc在RNASEH2B缺失小鼠的小腦中的積累增加。證實,RNASEH2的缺失通過積累復制相關損傷(包括基因組核糖核苷酸,R-loops和Top1cc)而損害神經細胞的基因組完整性。

           《獨立于I型干擾素信號傳導的基因組不穩定性驅動核糖核苷酸切除修復受損引起的神經病理學(Genome Instability Independent of Type I Interferon Signaling Drives Neuropathology Caused by Impaired Ribonucleotide Excision Repair)》一文中Top1cc檢測的酶免疫復合物檢測(immune complex of enzyme, ICE)工作流程,用了將密度梯度離心與Dot-Blot分析的方法,主要步驟包括:

           1)腦組織裂解物加載到CsCl梯度溶液上面(最終自行成密度梯度為0.84-1.72g/mL),用NVT90轉子42000rpm在25℃下離心20小時后,收集Top1cc的顆粒;

           2)Top1cc的顆粒經70%乙醇洗滌、干燥后,重懸于TE緩沖液,用25mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)稀釋后,用Bio-Rad Dot-Blot轉膜;

           3 先檢測Blot中的蛋白復合物中,后在室溫下用SYBR Gold染料對膜進行染色評估DNA的載量。


    1.4 亞細胞組分分離

           NVT轉頭在亞細胞組份分離的應用涉及了肌膜、肝臟、中樞神經系統等特定組織的細胞器組分,如線粒體、過氧化物酶體、高爾基體及囊泡、內質網、溶酶體、自噬體(autophagosomes)、細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)/外泌體(exosomes)等。

           自噬(Autophagy)是許多細胞譜系和腫瘤細胞系中高度保守的過程,包括細菌、病毒和寄生蟲在內許多病原體,可誘導受感染細胞的自噬。自噬缺陷與病毒感染的持續、腫瘤發生有關??乖徊娉蔬f(Antigen cross-presentation)對于誘導針對腫瘤細胞和感染性病原體的適應性免疫至關重要。但對腫瘤細胞或病原體來源抗原的交叉呈遞中自噬的調節相關機制了解不多。

           用Bortezomib(用作蛋白酶體活性的抑制劑和自噬的誘導劑)和NH4Cl(用于阻斷溶酶體融合和自噬體降解)處理轉染CFP-LC3和OVA抗原的HEK 293T細胞后,裂解細胞離心收集上清液,進一步以10000xg離心15 min獲得含自噬體的粗大囊泡粗提沉淀(包含有線粒體、溶酶體和自噬體)和含胞質組分組成的上清液(含富含GFP-OVA抗原、胞質蛋白和微粒體等)。

           將含粗大囊泡部分沉淀重懸于percoll梯度溶液,用NVT65近垂直轉頭36000g離心30分鐘后,收集各梯度層的組分(自噬體囊泡密度低于線粒體和溶酶體,可通過密度梯度離心將自噬體囊泡分離),從中回收自噬體囊泡。聯合使用綿羊抗小鼠IgG、小鼠抗GFP抗體對GFP-LC3標記的自噬體進行層析處理,收集流過、洗滌和洗脫液的各層析組分后進行進一步抗原呈遞分析和Western Blot檢測。

           實驗顯示:抑制自噬幾乎完全消除了交叉呈遞,而誘導自噬顯著增強腫瘤抗原的交叉呈遞。NH4Cl阻斷自噬體和溶酶體之間的融合,增強了交叉呈遞。研究人員還成功將蛋白質抗原Ub-V-GFP-OVA在HEK293T細胞中的LC3陽性自噬體位點進行了定位。而使用黑色素瘤細胞的實驗,也發現富含自噬體的測試組分介導了gp100抗原與幼稚pmel-1 T細胞的交叉呈遞。

           該研究不僅確定了自噬體是抗原隔離、呈遞給樹突狀細胞的抗原載體,而且交叉呈遞OVA的能力與自噬體的量直接相關。提示自噬體在開發針對癌癥和傳染病治療有效疫苗的巨大潛在價值。

           迄今為止,依托超速離心技術建立的最復雜實驗分析方法恐怕非hyperLOPIT (hyperplexed LOPIT)和LOPIT-DC (LOPIT after Differential ultracentrifugation)技術莫屬。

           LOPIT是localization of organelle proteins by isotope tagging (同位素標記蛋白細胞器定位分析技術)的簡稱,是一種既集成有蛋白多肽片段串聯質譜標簽(Tandem Mass Tag, TMT)技術、LC-MS/MS蛋白串聯質譜分析技術(tandem mass spectrometry)或SPS (Synchronous Precursor Selection)-based MS3 technology使用串聯質譜(MS / MS)或基于同步母離子選擇的SPS-MS3技術(synchronous precursor selection MS3 )和Bayesian temporal clustering analysis(Bayesian時間聚類分析)蛋白細胞器定位分析算法,又融合亞細胞組分超速離心分離的技術,用于表征和量化蛋白質亞細胞定位(每輪運行最多分析16種)的新型空間蛋白質組學方法(spatial proteomics),可將數千種蛋白質原生態地精確定位到不同的亞細胞器(subcellular structures Or organelles),分析胞內區室(intracellular compartments Or cellular compartments)間蛋白質定位、定位功能失調(Dysfunctional protein localization)、蛋白在亞細胞間動態穿梭事件的中斷(disruption of dynamic shuttling events),借此分析蛋白在細胞的生理功能或病理進程中所扮演的角色。

           LOPIT由劍橋大學生物化學系劍橋蛋白質組學中心的K. S. Lilley等人2004年發布,后又在此基礎上于2016版推出迭代HyperLOPIT(細胞裂解流程、MS數據采集和蛋白質定位分類算法有進一步改進)、2019年的LOPIT-DC版。HyperLOPIT與LOPIT-DC兩套實驗流程的總體步驟、內容基本一致,區別在于第一階段細胞裂解之后細胞器、膜蛋白離心分離純化的方法路線。

    Beckman Optima XE-100 Optima XE-90超速離心機NVT 65近垂直轉頭應用于LOPIT同位素標記蛋白細胞器定位分析實驗.jpg

           HyperLOPIT分析流程中,小鼠胚胎干細胞 ES-E14TG2a總蛋白的分離包括2項內容。

           1)一份培養細胞用去垢劑裂解,經洗滌去除胞質蛋白和膜蛋白,完成細胞核的富集和核蛋白質提??;

           2)另一份細胞裂解,去除細胞碎片后,采用碘克沙醇的不連續密度梯度100000xg在4℃離心60分鐘,分別收集含可溶性胞質蛋白的上清、兩個密度梯度溶液界面處的粗膜。

           粗膜組分用裂解緩沖液稀釋后,先經200000g下4℃離心40分鐘沉淀,再將膜沉淀重懸,用連續密度梯度100000g在4℃離心8 小時,分別收集各浮力密度(buoyant density)帶的膜蛋白組分共20×0.5mL份。

           再將收集的20份膜蛋白組分經180000g離心20分鐘后,收集沉淀。

           上述蛋白提取流程中,僅超速離心步驟就消耗了10個小時。

           LOPIT-DC是把hyperLOPIT方案中細胞裂解、MS數據采集和蛋白質定位分類算法優勢與亞細胞組分差速離心方法相結合而開發的流程。在去除細胞勻漿液中殘留細胞后,依各種膜組分沉降速度不同,用差速離心、速度梯次逐級增加的方法,分別收集膜蛋白、可溶性蛋白組分的沉淀分析。相較于hyperLOPIT工作流程的耗時冗長、人力技術資源和樣品材料大量耗費,LOPIT-DC的蛋白分離操作簡單經濟,制備時間縮短近三倍,并實現和接近hyperLOPIT水平的分辨率和蛋白質亞細胞定位結果。

           hyperLOPIT流程中單獨染色質和核蛋白制備步驟的引入,有利于分離染色質相關蛋白和其他核蛋白,為核蛋白定位提供更好的解析分辨率。而LOPIT-DC流程對線粒體和過氧化物酶體的高效分離,對于研究線粒體、過氧化物酶體、細胞質或蛋白酶體更便利。

           從LOPIT、HyperLOPIT再到LOPIT-DC,都無須純化細胞器來抽提蛋白成份。相反,收集到的多管蛋白在經TMT技術標記后,還會混合同時進行質譜分析。而膜蛋白的交叉污染在質譜后數據分析過程中,通過細胞器蛋白定位多變量聚類分析中予以鑒別。這樣既可以判定具有多個亞細胞結構區室間分布定位特點的蛋白質,又可實現特定蛋白在特定胞內區室分布豐度的量化及不同干預刺激、病理生理過程中的動態變化。

           LOPIT及后續改進技術方法,已在包括擬南芥根部和根來源的愈傷組織,黑腹果蠅胚胎,釀酒酵母細胞,HEK293人腎細胞系,DT40雞淋巴細胞系, E14TG2a小鼠胚胎干細胞,人肺成纖維細胞巨細胞感染和大鼠肝臟細胞器等多個蛋白亞細胞器定位研究項目成功應用。


    1.5 Beckman NVT轉頭實驗應用情況小結
            截止至2023年6月30日的PubMed期刊文獻數據,Beckman 超速離心機轉頭在實驗報道中出現的頻率,從高到底排名秩序依次是:SW 系列水平轉頭、Type Ti系列定角轉頭、NVT系列近垂直轉頭和VTi 系列垂直轉頭。其中,僅SW 41Ti這款水平轉頭(6×13.2mL/41000rpm)的報道文獻記錄就多達5943條。而使用Type系列角轉頭、NVT系列近垂直轉頭或VTi系列垂直轉頭中任一款轉頭的文獻記錄數量總和不過800次。NVT 65型近垂直轉頭的刊文數量相當于報道使用了VTi 全系列垂直轉頭的刊文量之和。

            資料顯示:最早對Beckman近垂直轉頭用于實驗樣品分離公開報道的是美國馬薩諸塞州波士頓布萊根婦女醫院醫學部的研究小組。他們在1994年用KBr將人體血漿調節至1.21g/ml的密度后,在NVT90近垂直轉頭中以80000rpm、不連續密度梯度超速離心45分鐘,從新鮮血漿制備低密度脂蛋白(LDL) 。調研收集的NVT應用文獻中,55%實驗成果發表于2012-2023年間??紤]到定角轉頭、水平轉頭是最早成功投入商品化服務轉頭類型,再結合單一型號轉頭文獻報道量,可以看出,NVT轉頭使用增長的勢頭明顯,證明了NVT轉頭的巨大應用潛力。
            近垂直轉頭因為有一定傾角,被分離樣品可沿管壁向外、向下滑向管底而產生沉淀。這給人的直覺是轉頭主要特長是用于蛋白和細胞組分沉淀分離。調研所收集的文獻中,確有多篇與此應用有關。
            如用NVT90轉子4℃下80000rpm離心1小時收集PBS緩沖液中類鼻疽菌Burkholderia pseudomallei外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)的沉淀以純化菌體包膜用作免疫動物的抗原。對于人體皮膚真菌群的共生真菌M. sympodialis釋放細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)MalaEx,用到NVT90轉子100000g離心沉淀的辦法制備感染單核細胞及人原代角質形成細胞的感染源。將轉染攜帶跨膜蛋白Megf10基因逆轉錄病毒載體的10T1 / 2成纖維細胞裂解后,用NVT100轉子4℃下65000rpm離心1小時,將細胞質,質膜,核膜和核區室的蛋白質分級沉淀分離,可從中驗證Megf10在細胞質膜中的分布定位。研究研究人員為探究鞭毛內轉運復合物A(intraflagellar transport complex A, IFT-A)的整體結構及組裝機制,將原生動物四膜蟲(Tetrahymena)全細胞提取物經離子交換色譜層析后,再用NVT65.2轉子100000×g在4℃下離心1.25小時沉淀胞膜以純化IFT-A用于后續其組成結構的分析。
            需指出,就目前掌握的資料看,近垂直轉頭的沉淀功能實際使用并不普遍。相反,大部分實驗報道中,是用于單一蛋白組分或蛋白復合體、基因組DNA/質粒/RNA、rAAV病毒載體、細胞的細胞器和外泌體和膜脂肪酸等各類生物樣品的連續或不連續密度梯度的分離。NVT用于區帶速度離心和生物組分自形成梯度等密度離心,這一點毋庸置疑。

    (待續:試析近垂直轉子在超速離心中的應用-下)

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