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  2. 產品課堂

    雷霆收罷江海凝 —— 試析近垂直轉子在超速離心中的應用-下

    (續:試析近垂直轉子在超速離心中的應用-中) 

    2、超速離心實驗中NVT轉頭的應用價值

           全球有Beckman、日立Himac(已并入德國eppendorf)和賽默飛Sorvall三大超離制造商。受限于技術小組人力和時間,我們僅選擇了Beckman落地式超速離心機的近垂直轉頭作為考察目標。

           基于調研結果,我們來討論本文開頭提出的問題:NVT轉頭的性能優勢、開發與使用NVT的特殊意義。


    2.1 NVT轉頭應用的獨特技術優勢
           超速離心時,溶液中的生物組分粒和蔗糖、CsCl等梯度介質分子在相當于105~106倍重力加速度強度的離心場中克服阻力水平離心方向遷移(沉降)。一定時間后,自動形成內側低、外側高的介質濃度分化(溶液密度)分布格局。各種被分離組分則依自身沉降速度或密度不同,在介質相應濃度區帶中聚集,形成多條相互間隔一定距離、可視化的絮狀條帶。 

     Optima XE-90超速離心機垂直轉頭密度梯度分離原理演示圖.jpg       

            上圖形象地描繪了樣品、梯度介質溶液層在超速離心過程中液體層從變形、分層再重新定位的演變過程。這足以說明,密度梯度離心分離過程,主要是由超強的離心場和相對微弱的重力場這兩種機制共同作用下促成的。而維持梯度介質溶液的密度由內向外逐漸走高分布的是離心場。

            不同密度帶在管底處產生的液體壓強不同:靠外側密度相對較高的液柱壓強大。當離心力減弱到一定程度后,在重力場作用下,最外側液體密度帶,向內推擠靠內側較低密度的液層使之向內、橫向偏移而偏離豎直狀態??客鈧雀呙芏葪l帶則順勢進駐密度較低條帶原先占據的空間并持續擴張。不同密度條帶因底部發生向心性擺動,使得在超速運行時呈現規整豎直狀態的各密度液體層因此而出現傾斜變形、條帶高度的降低。最終在持續的離心力衰減和重力雙重作用下,各密度層內液體由豎改平、管內液體密度呈現上層低、底部高、垂直排列的穩定格局。相應地,被裹挾在各密度層內的樣品條帶,體位也隨之出現了90°旋轉。
            在不發生劇烈振蕩造成液層重混失誤情況下(為避免離心結束轉頭剎車過程中發生已分離樣品條帶重混的風險,可采用優化Optima XE-90、Optima XPN-90超速離心機的減速速率設置,使轉頭盡可能平緩地減速),完成旋轉并重新定位的液體,因底面積變小,各密度液層厚度都將增加,分布于各密度層內的被分離目標條帶自身條帶厚度增加的同時,相鄰條帶的間距也隨之增大。離心管長度越長,條帶間距的拉伸效果越顯著。。

    Beckman Optima XE-100 Optima XE-90超速離心機NVT 100_NVT 90_NVT65_NVT 65.1近垂直轉頭用于連續密度梯度離心原理圖.jpg

            轉頭在設定轉速下運行時,兩組相鄰條帶的間距為d1,轉頭剎車后二者間距為d2,設定NVT轉頭管-軸夾角θ,則d2 = d1/cosθ。顯然,d2 > d1。當將樣品管取出靜置時,隨著液層底面積縮窄,液層厚度更厚,相鄰條帶間距會在d2基礎上進一步加大,故d3 > d2。
           NVT轉頭與垂直管轉頭、定角轉頭相同之處在于樣品沉降距離短,有效分離所需時間短。NVT轉頭有一定傾角,樣品中組成成份接近或沉降系數(sedimentation coefficient)相近的條帶在分離結束、離心管取出后,條帶相互間距加大,利于逐個條帶收集操作,減少操作失誤和污染。這一點比使用垂直轉頭時更便利。而相對于傾斜角度高達20°-45°的定角轉頭, NVT轉頭的沉降距離更短,分離所需時間縮短、效率提高。
           從這一角度看,NVT轉頭沉降距離適中、分離后的條帶間距大,既保證離心效率,又兼顧對樣品中密度相近組分的分離質量,實現了效率和分辨率的統一。 

     

    2.2 NVT轉頭應用的獨特效率優勢
           上個世紀80年代開始,分子生物學實驗技術迅猛發展,對核酸純化需求極其強勁。在NVT轉頭投產前,菌體質粒DNA或基因組的分離純化常用甩平轉頭進行。CsCl初始密度1.71g/cm3在20℃條件下33000rpm離心,可獲得高純度DNA,但每輪離心耗時超過70個小時,效率極低。
           超速離心機制造商推出NVT轉頭的初衷,正是用于取代常用的水平轉頭以實現快速CsCl梯度離心純化質粒/DNA等樣品。若改用NVT轉頭,加入EB和Triton x-100后使CsCl梯度溶液上樣密度降低至1.55g/cm3,用78000rpm、20℃條件下完成相同樣品離心,任務時間可縮短至4小時。
    為何高轉速的NVT轉頭離心可以節省離心時間?
           超速離心達到一定時間后,密度梯度介質形成近軸端濃度低而遠端濃度高的溶液濃度梯度(密度梯度)布局,即“自成梯度”現象。如上樣時初始密度1.55g/cm3的CsCl溶液,最終形成了從近-遠方向0.84–1.72g/cm3的新密度分布態勢。
           一般來說,相同溫度條件下,梯度介質密度增加,不僅是溶液對樣品顆粒的浮力阻力增加,溶液的粘度也會隨之升高,故樣品組分遷移時所受的摩擦阻力也增加。當樣品所受正向離心力與介質溶液施加的反向阻力達到平衡后,原本緩慢沉降的樣品迅速減速并最終停滯在特定位置、特定密度介質層中。收集處于不同位置的樣品條帶,通過折射儀檢測后,即可獲得該組分在特定實驗離心條件下的浮力密度值。
            可見,樣品的浮力密度值與特定實驗所用的轉頭性能屬性、溫度條件、工作轉速、梯度介質類型與濃度均有關系。同種樣品組分,實驗條件不同,則測得的浮力密度數據,只可能比較接近,但難以完全一致。而正式超速離心實驗刊文,一般無須提供樣品的浮力密度數據。實際工作中,人們可參考前人提供的待分離樣品組分浮力密度測試值,設計和優化實驗所需的梯度介質類型、介質溶液初始上樣濃度,選擇介質的不連續階梯密度或連續密度梯度的分離方案。
           樣品組分的浮力密度值與樣品的沉降系數、在特定和梯度介質溶液中的遷移距離、有效分離所需時間的長短有直接關系。

           上文列舉的質粒DNA CsCl梯度離心,屬自形成連續密度梯度離心(continuous density gradient centrifugation)或平衡等密度離心。自形成梯度密度離心時間的計算公式為:

    超速離心機連續密度梯度分離離心時間計算公式.jpg

           公式中: N為離心實際工作轉速(rpm); ρP 為離心后樣品條帶所處位置離心介質的密度(代表該樣品組分的浮力密度);rp 為樣品條帶所處位置的離心半徑值(從旋轉軸心沉降到等密度帶的距離);β0為梯度介質的密度梯度比例常數;S20.W代表樣品組分在20℃純水中的沉降系數。

           該公式表明:
           1)采用同一轉頭離心時,提高工作轉速,將節省離心時間。

            隨著轉速提高,梯度介質生成的密度-離心半徑構建的曲線斜率增加。越接近離心管底部(外側),密度曲線的斜率越大。而密度梯度曲線變陡,則不僅使單一組分聚集形成的條帶縮窄,而且不同浮力密度組分所生成的各條帶之間分布更密集。
            而基于前面NVT轉頭技術優勢的討論意見, 當相鄰組分條帶的間距相近時,NVT轉頭要比甩平轉頭離心后的條帶收集操作更便利。
           2)轉速相同,不同轉頭離心半徑不一,其梯度介質密度梯度曲線大相徑庭,造成同種樣品組分條帶的分布位置存在差異。

            如圖所示,甩平轉頭的rp顯然大于角轉頭和NVT轉頭。從NVT 90轉頭和SW60 Ti兩款轉頭60000rpm轉速、20℃溫度、相同初始濃度CsCl溶液離心相同時間后所形成的自成梯度曲線圖中可以看出,ρP=1.60g/mL梯度條帶對應的rp,NVT 90轉頭中為57.1mm,而SW60 Ti轉頭為112.7mm,其差異之懸殊顯而易見。

    Beckman Optima XE-100 Optima XE-90超速離心機NVT 90 NVT65近垂直轉頭CsCl溶液連續密度梯度曲線圖.jpg

           3)相同樣品組分、溫度、初始梯度介質溶液和轉速情況下,樣品組分實際ρP值有出入,但十分接近。故兩種離心環境下ρP-1值接近。但rp則不同:樣品條帶所處位置rp中,甩平轉頭的rp比NVT轉頭的rp值大得多。

            根據公式計算結果是:樣品在NVT轉頭完成分離所需離心時間將明顯少于甩平轉頭的用時;若在NVT轉頭上采用更高轉速,則離心時間還有進一步壓縮的空間。


    2.3 轉頭離心效率的簡單評估方法
           先看一下Beckman 超速離心機NVT、SW轉頭工作性能比較表。
    轉頭的k-Factor(k因子)可簡單地概括為:
           1)K數值越小,則轉頭分離效率越高;
           2)它對應于轉頭的Rmax/Rmin比值、轉頭最高工作轉速;
           3)運行轉速降低和最大有效離心半徑減小,K因子數值會升高。表2列出了各轉頭在不同轉速條件下K數值的變化。
           對使用者而言,K因子的價值在于可用于衡量轉頭離心效能和離心時間的簡單評估。
           在樣品、離心介質溶液和溫度都一致情況下,有效離心時間與K因子成正比,與樣品組分沉降系數成反比。

           用公式可表示為:

    T=K/S

           基于沉降系數與樣品浮力密度密切相關,采用不同轉頭時測定的沉降系數略有出入。因此,公式可以用于樣品有效離心時間長短的簡單粗略評估時參考。這一點,無論Beckman Microfuge 16臺式微量高速離心機、Allegra X-30R臺式冷凍離心機、Avanti JXN-26 Avanti J-26S XP立式大容量低溫高速離心機,還是Optima XE-90、Optima XPN-80Optima XPN-100超速離心機都適用。

    表2. Beckman 超速離心機NVT、SW轉頭工作性能比較表

    Rotor Capacity

    Speed

    RCF max

    RCF av

    RCF min

    R max

    R av

    R min

    k-factor

    Rotor Capacity

    Speed

     

    RCF max

    RCF av

    RCF min

    R max

    R av

    R min

    k-factor

    SW 60 Ti

    (6×4 mL)

    60000 rpm

    484289 ×g

    120.3 mm

    45.0

    NVT 100

    (8×5.1 mL)

    100000 rpm

    80371 rpm

    75680 rpm

    749223 ×g

    484289 ×g

    369155 ×g

    67.0m m

    57.6 mm

    48.3 mm

    8.0

    12.4

    369155 ×g

    91.7 mm

    14.0

    NVT 90

    (8×5.1 mL)

    90000 rpm

    78019 rpm

    73063 rpm

    645000 ×g

    484289 ×g

    369155 ×g

    71.1 mm

    61.8 mm

    52.4 mm

    10.0

    254020 ×g

    63.1 mm

    13.3

    15.2


    SW 55 Ti

    (6×5 mL)

    55000 rpm

    367022 ×g

    108.5 mm

    48.0

    NVT 100

    (8×5.1 mL)

    100000 rpm

    66633 rpm

    69967 rpm

    749223 ×g

    286175 ×g

    367022 ×g

    67.0 mm

    57.6 mm

    48.3 mm

    8.0

    18.0

    16.3

    286175× g

    84.6 mm

    NVT 90

    (8×5.1 mL)

    90000 rpm

    64329 rpm

    67920 rpm

    645000 ×g

    286175 ×g

    367022 ×g

    71.1 mm

    61.8 mm

    52.4 mm

    10.0

    19.6

    17.6

    205667 ×g

    60.8 mm

    NVT 65.2

    (16×5.1 mL)

    65000 rpm

    57114r pm

    60185 rpm

    416000 ×g

    286175 ×g

    367022 ×g

    87.9 mm

    78.4 mm

    68.8 mm

    15.0

    19.4

    17.5


    SW 41 Ti

    (6×13.2 mL)

    41000 rpm

    287792 ×g

    207150 ×g

    126696 ×g

    153.1 mm

    110.2 mm

    67.4 mm

    124.0

    NVT 65

    (8×13.5 mL)

    65000 rpm

    402000 ×g

    84.9 mm

    21.0

    55039 rpm

    287792 ×g

    72.2 mm

    29.3

    50636 rpm

    207150 ×g

    59.5 mm

    34.6


    SW 40 Ti

    (6×14 mL)

    40000 rpm

    284123 ×g

    201642 ×g

    119339 ×g

    158.8 mm

    112.7 mm

    66.7 mm

    137.0

    NVT 65

    (8×13.5 mL)

    65000 rpm

    402000 ×g

    84.9 mm

    21.0

    54687 rpm

    284123 ×g

    72.2 mm

    29.7

    49958 rpm

    201642 ×g

    59.5 mm

    35.5


           采用5mL樣品管,梯度介質和離心溫度均相同時,SW 55 Ti在最高轉速55000 rpm工作時,分離時間將是此轉速下NVT 65.2離心用時的2倍以上。而若采用NVT 65.2最大工作轉速運行,則離心時間進一步降低至SW 55 Ti轉頭用時的1/3。
           超速離心機制造商開發NVT轉頭,真可謂用心良苦哈!

     

    2.4 應把握好NVT轉頭帶來的機遇

           超速離心實驗耗時冗長,少則數十分鐘,多則持續十幾小時甚至24小時以上。單臺機器可接待實驗人次均明顯少于普通臺式低溫離心機。超離實驗多的單位,超速離心機資源往往十分緊張。而新購超速離心機、添置轉頭升級的花費不菲,眾所周知。
           科研的研究對象繁雜,所用轉頭類型和工作條件難以統一。而超速離心轉頭有4種功能類型,每一種類型的轉頭按轉速、單管容量(4ml - 38.5mL)分為多個型號。超速離心機管理部門要將如許多種轉頭配齊,所需預算之浩大將超乎想象。而做到用盡可能少的轉頭配置滿足盡可能多的應用需求,需要管理服務部門轉變觀念,充分了解每種轉頭的功能特性。這有利于發揮資源配置優勢,提高設備服務效益。
            中小企業超速離心應用流程對轉頭性能的需求相對固定。通過提高超速離心機運行效能,避免單純依靠增加設備數量的單一途徑來擴大產能,是減輕設備投資成本壓力的有效解決方案。

           資料表明,NVT類型的轉頭在超速離心機轉頭中資歷雖淺,但功能及應用范圍,與使用頻次最高的水平轉頭并無二致。通過優化運行參數條件,用NVT轉頭承擔一部分水平轉頭的離心工作,從理論到技術上都具有可行性。
           然而,實際工作中所用超速離心程序設置,或基于既有工作規范,或參考同類實驗文獻提供的實驗條件數制定。要充分發揮NVT轉頭多面手優勢,首先要面臨的難題是:如何基于現有水平轉頭上的工作參數,制定樣品轉移到NVT轉頭高效離心的所需參數設置。
           我們認為,無論采用何種轉頭工作,運行參數的設定須滿足兩個基本條件,首先是密度范圍有效,其次是離心力指標有效。
           密度范圍有效,是指在設定轉頭設定工作條件下,要確保樣品中各目標組份在分離后都包含在梯度介質溶液所形成的密度范圍內,理想的密度梯度曲線還應使分離組分聚集的條帶盡可能窄。
           離心力指標匹配,是指新的工作轉速對應的最大與最小離心力要優于或與原工作離心力等效,滿足樣品組分離心所需最低離心力條件。

    Optima XE-100_Optima XE-90_Optima XPN-100_Optima XPN-90_Optima XPN-80 超速離心機NVT 65近垂直轉頭 SW41 Ti水平轉頭CsCl連續密度梯度曲線.jpg

           下面以SW41水平轉頭和NVT65近垂直轉頭的密度梯度曲線對比圖為例予以說明。
           采用相同初始濃度的CsCl梯度介質溶液上樣、離心溫度統一設定為20℃。當SW41轉速為30000rpm時,介質自形成密度的范圍為1.19 ~ 1.87g/mL。當轉速設定為35000rpm時,介質密度范圍為1.06 ~ 1.86 g/mL。若將樣品轉移至NVT65上離心,只有轉速65000rpm對應的介質梯度范圍1.26 ~ 1.86 g/mL與SW41對應的30000rpm工作條下梯度密度生成范圍最匹配,可以同時兼顧所有條帶的浮力密度范圍。
           經過簡單計算,30000rpm時SW41轉頭離心力范圍為67832 ~ 110934×g;轉速35000rpm時離心力范圍是92330 ~ 150993×g。而NVT轉頭在設定轉速條件下,離心范圍為281113 ~ 341040×g,均高于原離心力指標,確保離心力可以使被分離組分有效離心。
           上述兩個條件均不理想時,應以密度梯度范圍的匹配作為優先原則調整NVT轉頭轉速的設定。就此處案例而言,用NVT65轉速65000rpm取代SW41轉頭30000-35000rpm轉速離心,是切實可行的。
           從表2可知, NVT65轉頭采用65000rpm工作轉速取代SW41轉頭30000rpm離心相同樣品時,在兩種情況下浮力密度接近的情況下,根據K因子與沉降系數離心時間評估方法,NVT65有效離心時間約為SW41轉頭的10%,可見優化離心工藝對離心效率提升的巨大價值。

            因此,在制定超速離心機轉頭配置方案時,在單管樣品容積同等條件下,角轉頭、垂直轉頭和NVT轉頭及水平轉頭四者中,可將NVT轉頭作為優先選項。
           如NVT 65(8×13.5mL; 65000rpm)近垂直轉頭、Type 70.1 Ti(12×13.5mL; 70000rpm)角轉頭、VTi 65.1(8×13.5mL;65000rpm)垂直轉頭與水平轉頭SW 41 Ti(6×13.2mL; 41000rpm)SW 40 Ti (6×14mL; 40000rpm)之間,可首選NVT 65。
           在水平轉頭SW 32 Ti(6×38.5mL; 32000rpm;k Factor=204)、SW 28(6×38.5mL; 28000rpm;k Factor=246)之間,按K因子值從低到高排序,可首選SW 32 Ti。

           為盡可能照顧實驗人員操作習慣、簡化管理服務工作,SW 32 Ti(6×38.5mL; 32000rpm)水平轉頭、VTi 50.1(12×39mL; 50000rpm)垂直轉頭和兩款角轉頭Type 50.2 Ti(12×39mL; 50000rpm)、Type 70 Ti(8×39mL; 70000rpm)中,SW 32 Ti優先,可能會讓實驗者更覺暖心一點。

           在確保操作規范安全前提下,用優化超速離心運行參數設置的方法,可充分發揮NVT轉頭高效便利優勢,迅速提升設備產能,大幅減輕設備操作和管理負擔,具有巨大經濟社會效益,也是超速離心機管理者和使用者從我做起、踐行低碳節能工作理念的集中體現。

     

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