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  2. 產品課堂

    雷霆收罷江海凝——Optima MAX-XP臺式超速離心機在外泌體分離中應用的主要類型

    (前續:Optima MAX-XP臺式超速離心機是如何成為細胞外囊泡分離神器的?

           外泌體(small Extracellular Vesicles/sEVs;習用名exosome/EXO)是由細胞內多泡內體(multivesicular endosome, MVE)與細胞膜融合后通過胞吐作用釋放到細胞外、直徑30 - 150nm的小型囊泡。外泌體、微囊泡(medium EVs /mEVs;習用名microvesicle, MV)和凋亡小體(large EVs / lEVs; 習用名apoptotic body/AB)共同組成細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)群。外泌體可由造血細胞、B細胞、T細胞、樹突細胞、神經元、和腸上皮細胞等所有類型的真核細胞釋放,遍布于血漿/血清、羊水、腹水、乳汁、尿液、關節腔積液、腦脊髓液及細胞培養基等各種生物體液中。

           外泌體攜帶源自其親本細胞的膜質和細胞質成份。磷脂雙層膜中嵌入了源自親代細胞的蛋白質和脂質。四跨膜蛋白CD9、CD63 和CD81及腫瘤易感基因101 蛋白(TSG101)被視為外泌體管家標記。囊泡內包含如β-連環蛋白ADP-核糖基化因子(ARF) 1、表皮生長因子受體(EGFR)、粘蛋白1 (MUC1)、磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)、mRNA、microRNA(miRNA)、長非編碼RNA(lncRNA)、及脂質相關蛋白和磷脂酶等多種參與信號轉導的分子。外泌體囊泡膜上的表面受體能被局部或遠程的受體細胞靶向并捕獲。外泌體與受體細胞結合后,可通過吞噬作用或與細胞膜直接融合的方式釋放囊泡內容物,完成細胞間調控信息的傳遞。
    1、多種外泌體分離方法中超速離心技術的地位

           對外泌體表面受體、內容物和與細胞功能的研究,首先要分離出足夠數量和純度的外泌體成分。外泌體囊泡作為納米尺度的微粒,無法通過常規濾膜過濾方法截留。胞外囊泡體型遠小于細胞(10-30 μm),而不同亞型的細胞外囊泡在離心場中具有不同的沉降速度。通過差速離心,就可將外泌體與樣品溶液中的蛋白質、微囊泡、凋亡小體、細胞及細胞碎片分離。國際細胞外囊泡協會(International Society for Extracellular Vesicles, ISEVs)2016年10月份發布的用于細胞外囊泡隔離和表征的技術的首次全球調查報告顯示,超速離心是最常用的外泌體分離方法(但不支持“金標準”的提法)。                                              

    細胞外囊泡發生原理.jpg

    2、Optima MAX-XP臺式超離在外泌體分離中的主要應用類型

           截至自2023年8月底,從Pubmed期刊數據庫中共采集到Optima MAX-XP臺式超速離心機用于胞外囊泡分離實驗、所發期刊2023年影響因子iFoid≥6.0的文章63篇。

           依所用外泌體分離起始樣品來源類型和流程差異,可梳理出至少以下9種代表性應用類型。

    2.1 細胞培養基外泌體分離

    2.1.1 培養細胞外泌體分離

    先將收集到的190mL細胞調節培養基2500×g離心30分鐘,除去細胞碎片和凋亡小體;

    上清20000×g離心60分鐘,分別收集沉淀所得的微囊泡組分、上清;

    上清用容量12×39mL的Type Ti 50.2超速離心轉頭4℃下110000×g離心2小時,沉淀小囊泡;

    收集的小囊泡經500μL PBS洗滌,用12×1.5mL容量的Optima MAX-XP超速離心機TLA-55角轉頭100000×g和4℃下離心2小時;

    然后將MV、外泌體沉淀重懸于50μL DPBS緩沖液中和將未使用并經超離排空自帶外泌體處理的對照培養基儲存在80℃用于后續分析。

     

    2.1.2 培養細胞外泌體分離和蔗糖密度梯度純化

    完整收集在無血清調節培養基中的培養物,在4℃下2000×g離心20分鐘除去細胞碎片,收集上清;

    上清用Optima L-80XP超速離心機6×94mL Type 45 Ti轉頭4℃下100000×g離心1.5小時;

    沉淀經PBS洗滌,用Optima MAX-XP超速離心機MLA 80轉頭100000×g在4℃離心1h;

    收集沉淀后重懸于100μL PBS中;

    將100μL外泌體樣品與1mL 60%蔗糖溶液混合后鋪墊于超速離心管底部,再將1mL 30%蔗糖溶液和1mL PBS依次上樣到樣品頂部。在Optima L-80超速離心機SW 55 Ti水平轉頭中4℃下150000×g離心16小時;

    收集每種餾分各1mL 并與6mL PBS混合以稀釋溶液中的蔗糖;

    用Optima MAX-XP超速離心機MLA-80轉頭150000×g離心1.5h,除去含蔗糖的上清,收集沉淀;

    將沉淀重懸于100μL PBS中儲存以備后續檢測。

     

    2.1.3 培養細胞外泌體分離和熒光標記

    完整收集細胞調節培養基,經1000×g離心10分鐘和2500×g離心25分鐘除去細胞碎片和凋亡小體;

    用6×250mL角轉頭將上清20000×g離心60分鐘,富集MV組分,同時回收上清;

    用Optima-LE 80K超速離心機Type 50.2 Ti轉頭將上清110000×g離心2小時沉淀外泌體;

    將沉淀重懸于DPBS中-80℃并儲;

    制備未與細胞接觸排空EVs的細胞培養基作空白對照;

    將與親脂性熒光示蹤染料與外泌體孵育后的待測樣品,用Optima MAX-XP超速離心機TLA-55轉頭110000×g離心1小時,除去未與EVs結合熒光染料;

    用與EVs相同的超速離心方案進行稀釋染料制備作為陰性對照。

     

    2.1.4 培養細胞外泌體和結構與質譜分析

    收集大鼠主動脈內皮細胞(EC)、血管平滑肌細胞(VSMCs)培養基,300×g離心10分鐘;

    2000×g離心20分鐘以除去細胞碎片;

    用Optima MAX-XP超速離心機MLS 50水平轉頭12000×g離心40分鐘,沉淀去除大囊泡和凋亡小體,收集上清;

    上清1100000×g超速離心70分鐘,并分為兩組;

    收集的一組沉淀經PBS洗滌重懸后用0.2μm濾器過濾, 110000×g離心70分鐘,用于透射電子顯微鏡或質譜分析;

    另一組沉淀經PBS洗滌后,經2輪70分鐘110000×g超離富集外泌體顆粒,重懸于 50–100μL PBS 中用于功能研究。

     

    2.2 尿液外泌體分離

    將50mL健康男性的尿液4℃下180x g離心10分鐘以除去細胞;

    再經1560×g、4℃離心20 分鐘沉淀鹽類結晶,收集上清,分成1mL等分-80℃儲存;

    將12個1mL尿液等分試樣37℃孵育解凍后合并,1560×g、4℃離心10分鐘除去析出鹽類晶體;

    上清用Optima MAX-XP超速離心機TLA-55轉頭154000×g,4℃下60分鐘,沉淀外泌體;

    沉淀經PBS洗滌重懸后,分成四等分儲存備用。

     

    2.3 腦脊液外泌體分離

    將4mL腦脊液加入含有8μL RNase抑制劑的13×51 mm PA超速離心管中,用PBS調節至5 mL;

    用Optima Max-XP 臺式超速離心機MLS-50 水平轉頭在8℃下120000×g離心80分鐘,減速設置為7;

    將細胞外囊泡沉淀與8μL RNase抑制劑在42μL PBS中孵育用于提取RNA。

     

    2.4 羊水外泌體分離

    收集羊水去除細胞碎片,4℃下20000×g離心30分鐘,收集細胞外囊泡(EVs)沉淀,并保留上清;

    將EVs沉淀重懸于15μL PBS中;

    上清轉移到11×34mm離心管中,用Optima MAX-XP超速離心機MLA-130轉頭4℃下100000×g離心2小時,棄上清;

    將沉淀重懸于1mL PBS,再次經超速離心,收集沉淀;

    將兩次富集的胞外囊泡沉淀合并后,重懸于PBS中,-80℃儲存。

     

    2.5 血液外泌體分離、表征和功能研究

    2.5.1 血漿外泌體分離

    將血漿分為兩組:一組1mL 用于表征實驗,另一組共4mL用于功能實驗。每組等分樣品用PBS稀釋至7-8mL;

    稀釋后血漿轉移至PC材質超離管(355630),用Optima MAX-XP超速離心機MLA-55角轉頭4℃下100000×g離心70分鐘,沉淀sEVs;

    棄上清,將sEVs于PBS(7-8mL)中洗滌后重懸,再次超離處理;

    將sEVs的沉淀PBS重懸至最終體積100-200μL,-80℃下保存。

     

    2.5.2 血清外泌體分離與質譜鑒定

    6-8周齡SD大鼠經安樂死后左心室心臟穿刺收集血液并轉移至15mL Falcon管靜置60分鐘;

    10000rpm離心10分鐘沉淀凝塊,收集上清;

    上清10000rpm離心10分鐘,棄沉淀收集上清;

    用等體積的PBS稀釋上清并以12000×g離心以除去其中的細胞碎片;

    以110000×g超速離心120分鐘,沉淀EVs;

    將EVs沉淀洗滌,重懸于PBS中

    再通過四輪PBS反復洗滌-超速離心后,重懸于尿素裂解緩沖液中用于質譜分析。

     

    2.6 牛奶外泌體分離

    從山羊和奶牛養殖場收集新鮮山羊奶和牛奶樣品;

    將牛奶和山羊奶在4℃下3000×g離心30分鐘以除去細胞碎片,細胞和脂肪,收集上清;

    上清4℃下50000×g超速離心1小時,并用0.22μm過濾器過濾獲乳清;

    用Optima MAX-XP超速離心機MLA-150角轉頭4℃下110000×g離心70分鐘,收集沉淀;

    將沉淀重懸于1X PBS,重復一次超速離心;

    將最終的沉淀懸浮在1×PBS中并通過0.22μm過濾器過濾后,-80℃儲存備用。

     

    2.7 腹水外泌體(ADE)的分離

    先將采集的腹水300×g下離心10min,同時收集上清、細胞沉淀-80℃保存(用于后續細胞成分的免疫組織化學分析);

    將上清2000×g離心20分鐘,并0.22 μm過濾器過濾;

    用Optima MAX-XP離心機100000×g離心70分鐘,將外泌體收集沉淀并溶解在PBS中,-80℃下儲存。

     

    2.8 真菌外泌體分離和碘沙醇密度梯度純化

    真菌細胞壁消化液過濾后,將12 mL樣品加入14×89 mm超透明離心管;

    Optima XPN-100 超速離心機SW 41 Ti 轉頭4℃、10000×g離心 30分鐘,去除菌體碎片;

    用移液管將大部分上清(11.5 mL)轉移到一支新離心管中,用新鮮0.7 M NaCl將體積補充至12 mL,4℃下60000×g離心90分鐘;

    用移液管除去11.5mL上清,將剩余的0.5mL沉淀重懸;

    EVs重懸液轉移到13×51 mm PC材質超速離心管中,用無菌 20 mM Tris-HCl pH 7.5補充至3 mL,用Optima Max-XP 超速離心機TLA100.3 轉頭4℃ 下40000×g離心60分鐘;

    棄上清留沉淀,并除去管上部3/4殘留液體;

    碘沙醇(Optiprep)不連續密度梯度液由40%,20%,10%和5%(v / v)四層組成。 將EVs顆粒重懸于1mL 20 mM Tris-HCl (pH 7.5)中,并與2 mL 60% Optiprep混合以形成40%濃度層。其余密度層通過在 20 mM Tris-HCl pH 7.5 中稀釋60% OptiPrep 儲備溶液配制。依次將每層密度溶液3 mL加入14×89 mm超清離心管中形成梯度,從40%溶液開始,以5%溶液結束。樣品管置于Optima XPN-100 超速離心機SW 41 Ti 轉頭中4℃ 下100000×g離心17小時;

    去除頂部3mL溶液,收集余下六個餾分,每個餾分1 mL,轉移至13×51 mm PC材質超速離心管中,用冰冷無菌 20 mM Tris-HCl將樣品體積補充至3.5 mL;

    在Optima Max-XP 超速離心機TLA100.3 轉頭中4℃ 下40000×g離心;去上清,將沉淀重懸于20 mM Tris-HCl中備用。

     

    2.9 組織細胞外EVs分離

    2.9.1 腫瘤組織中分離EVs

    從口腔囊狀細胞癌患者的腫瘤組織在清除殘留血液后,將腫瘤組織切成碎片,并用添加膠原酶IV和DNase I的RPMI-1640培養基進行處理后,在37℃下振蕩孵育1小時,將腫瘤組織細胞從細胞外基質中解離;

    500×g離心10分鐘,除去解離的組織碎片和單細胞沉淀,采集上清;

    將上清轉移到新離心管中,4℃下用2000×g RCF 10分鐘、10000×g RCF 45分鐘兩輪離心,去沉淀留上清;

    上清用Optima MAX-XP離心機MLA-130角轉頭4℃下120000×g離心70分鐘,去上清;

    收集沉淀并重新懸浮在PBS中保存。

     

    2.9.2 腦組織外泌體分離和純化

    生物材料:12個月大的C57BL/6J雄性小鼠的右半腦或人的冷凍腦組織200-300mg。

    將腦樣品從-80℃冰箱移至干冰,從干冰直接移至培養皿。用單刃剃須刀片粗切成1-5mm的腦碎片,用移液器將粗切組織轉移到含木瓜蛋白酶溶液的15mL錐形管中37℃消化15分鐘;

    4℃下300×g離心10分鐘,收集上清;

    上清用40μm網格過濾去除除細胞、碎片和未消化組織后,收集濾液;

    濾液在2000×g下離心10分鐘,去沉淀回收上清;

    將上清轉移到70mL PC超速離心瓶,加入冰冷PBS使總體積達到50mL;

    用 Type 45Ti角轉子4℃下10000×g 離心30分鐘(11000rpm,k因子:2218),收集上清;

    上清移液到另一個70mL PC超速離心瓶,4℃下100000×g離心70分鐘,去上清;

    將沉淀重懸于4℃ 50 mL PBS中洗滌;

    再次4℃ 100000×g離心70分鐘,去上清。

    低分辨率蔗糖密度梯度純化步驟:(略)

    高分辨率碘沙醇密度梯度純化步驟:

    將EVs沉淀重懸于1.5mL冰冷40%(V/V)碘沙醇溶液中,將該溶液鋪墊于14mL薄壁超透明管底部;

    依次將1.5m不同濃度的碘沙醇溶液(先 20%,然后 15%,13%,11%,9%,7%)分層鋪墊在EVs重懸液之上;最后將2 mL 5% 碘沙醇溶液作梯度液的頂部(14mL管從上到下,液體分層依次是2mL-5%,1.5mL -7%,1.5mL - 9%,1.5mL -11%,1.5mL -13%,1.5mL -15%,1.5mL -20%碘沙醇梯度液,1.5mL -EVs碘沙醇重懸溶液)

    Optima XE-90立式超速離心機水平轉子SW 40 Ti(40000rpm,k因子值137)在 4℃下200000×g 離心過夜 16小時,低制動設置;

    收集 1.25 mL頂部餾分1梯度液,轉移至4 mL冰冷PBS 的6.5 mL厚壁PC管中;

    收集餾分2 – 8各1.5 mL轉移至 4 mL冰冷PBS的 6.5 mL厚壁PC管中;

    稱量餾分1-7離心管,用PBS填充至11.00±0.02g;

    將餾分8分成兩個管,用PBS填充填充至11.00±0.02g;

    用MLA80轉子(46000rpm,k因子57)或用70.1Ti型轉子(40000 rpm,k因子94)在 4℃下100000×g 離心70分鐘;

    將各EVs密度餾分分別重懸于30μL冰冷PBS或30 μL AAB 中,以備后續BCA、蛋白質組學、轉錄組學、脂質組學和RNA分析。

     

    3、小結

           使用Optima MAX-XP臺式超速離心機進行的外泌體分離實驗中,最常用的起始樣品材料是CM培養基培養的各種哺乳動物組織細胞,其次是外周血/血清、動物來源的實體組織(腫瘤組織、腦組織、肌肉等)、尿液、腦脊液、腹水、羊水和牛奶。酵母菌等非哺乳動物來源樣品也見諸報道。

           從分離流程看,大部分實例參考的是《從細胞培養上清液和生物體液中分離和表征外泌體》文中的UNIT 3.22一節的“Basic Protocol 1:Purification Of Exosomes By Differential Ultracentrifugation”部分(以下簡稱“基礎流程1”)流程中描述的300×g——20000×g——10000×g——100000×g——100000×g五步差速-超速離心分離方法或一過濾二超離的替代方法。收集EVs沉淀直接用于電鏡、Western Blot蛋白和核酸實時熒光定量PCR檢測分析。

           考慮到目前所用基礎操作流程所得到的外泌體組分來源(除了胞質MVE來源的外泌體,還有亞細胞區室,如線粒體等來源的外泌體)、大小和功能的異質性,部分實例在兩輪超速離心外增加一次蔗糖或碘沙醇密度梯度離心,將含外泌體粗提物沉淀(實質是密度不同小囊泡群)進一步分離,收集不同浮力密度區帶的餾分,經第4次超離沉淀各密度餾分中外泌體顆粒的方法除去蔗糖上清,再收集外泌體用于各項表征分析。

           然而蔗糖用作密度介質時有其固有缺點。首先是蔗糖溶液的透壓高,除了0.25-0.3M 濃度范圍蔗糖溶液滲透壓(250-300 mOsm/L)與細胞內外液體基本等滲外,其他密度梯度層都是高滲壓溶液。蔗糖梯度液高滲會造成細胞器、囊泡等微粒脫水而變形甚至失活。其次,摩爾濃度相似的蔗糖溶液分層后容易發生擴散混合,阻礙了蔗糖高分辨率梯度生成。因此,蔗糖在分離EVs亞群方面僅部分有效。

           新型非離子惰性碘化復合物碘沙醇(iodixanol,Optiprep是Axis-Shield公司的注冊商品名)溶液粘度低,并可在很寬濃度范圍內配制成與細胞等滲的梯度溶液,不影響細胞的形態和活性。并且碘沙醇溶液粘度相對較低,可形成比蔗糖更窄的密度梯度,使得梯度介質具有很高的樣品組分密度分辨率。實驗表明,碘沙醇高分辨率密度梯度液所獲得的總EVs產量與蔗梯度液接近,可區分胞質來源的外泌體和線粒體衍生外泌體(mitochondria-derived mitovesicles)。用碘沙醇取代蔗糖作為密度梯度介質純化所得的外泌體,功能活性和形態結構保持完好,特別適合功能和電鏡分析。 

    (后續:Optima MAX-XP臺式超速離心機在外泌體分離流程中轉頭的運用)

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