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  2. 產品課堂

    雷霆收罷江海凝——Optima MAX-XP臺式超速離心機在外泌體分離流程中轉頭的運用

    (前續:Optima MAX-XP臺式超離在外泌體分離中的主要應用類型)

           《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》一文(即“基礎流程1”,可參考《外泌體超速離心分離法基礎操作流程 (譯稿)》)中列出了多款適用于外泌體分離的立式、臺式超速離心轉頭。
            其中,立式超速離心機適用的轉頭有:

           水平轉頭SW 41 Ti(6×13.2 mL);

           水平轉頭SW 40 Ti(6×14.0 mL);

           水平轉頭SW 32 Ti(6×38.5 mL);

           水平轉頭SW 28 Ti(6×38.5 mL);

           角轉頭Type 70 Ti(8×39 mL);

           角轉頭Type 45 Ti(6×94 mL)。

           臺式超速離心機適用的為:

           角轉頭TLA-100.3(6×3.5 mL);

           角轉頭TLA-110(8×5.1 mL)。

           單管容量39mL、94mL的角轉頭用于對大量CM培養基自帶外泌體的排空處理。38.5mL容量轉頭常被用來替代高速離心轉頭執行10000×g下細胞碎片/較大微囊泡/凋亡小體沉淀的任務。SW 41 Ti和SW 40 Ti水平轉頭主要用于13.5mL體積上清的第一輪100000×g離心操作。
    初始材料體積在5mL以內的分離實驗,則在臺式超離上用3.5 mL、5.1 mL兩種轉頭完成兩輪超速離心、密度梯度純化分群處理。相較于1.5mL、2.0mL的微量管,3.5 mL、5.1 mL兩種超速離心管的管身長,梯度液柱長,特別是對包含多個密度組分梯度純化操作中,各密度餾分間距較大,收集時對移液操作的精細程度降低,更方便。其次,這兩款轉頭分離效能高,且可完美兼容1.5 - 2.0mL超速管,故使用上更高效靈活。

    1、在外泌體超速離心分離流程中轉頭的使用方法

           對應初始材料體積5mL以內的實驗流程,可在臺式超離上借助于3.5 mL、8×5.1 mL轉頭完成兩輪超速離心、密度梯度純化分群處理(相較于1.5mL、2.0mL的微量管,3.5 mL和5.1 mL超速管,管身長,梯度液柱長,特別是對包含多個密度組分梯度純化操作中,餾分分布間距較大,收集組分時對操作精細程度降低,更為方便。其次,是所列這兩款轉頭分離效能高,且可完美兼容1.5 - 2.0mL超速管。故使用上更加高效靈活)。

    調研收集的63個外泌體分離應用實例中,明確注明超離轉頭型號、可查實轉頭型號的為37例。所用轉頭單管容量最小1.5mL(LTA-55),最大94mL(Type 45 Ti)。

           多數報道用Optima MAX-XP臺式超離單一轉頭完成外泌體分離。譬如,對腫瘤細胞分泌的外泌體分離實驗中,細胞外液經歷500×g離心10分鐘、2000×g離心10分鐘和10000×g離心45分鐘后。用MLA-130角轉頭4℃下120000×g離心上清70分鐘完成外泌體分離。在對源自年齡相關性黃斑變性(AMD)患者特異性視網膜色素上皮細胞(RPE)攝取細胞外囊泡(AMD RPE EVs)的共聚焦顯微分析實驗中,將事先分離獲得的20μL AMD RPE EVs,加入1.2 mL DPBS,用TLS-55水平轉子4℃下130000×g離心1小時完成沉淀。而為評估脂肪衍生的細胞外囊泡(EVs)在肥胖代謝紊亂中對脂肪因子分泌失調的作用。從代謝綜合征患者外周血的血漿分離微囊泡(MVs)和外泌體(EXO)。20mL全血以260×g離心15分鐘后,將富血小板血漿(PRP)與全血分離,并在1500×g下離心15分鐘,得到無血小板血漿(PFP)。將PFP以21000×g離心45分鐘以沉淀MV。將MV耗盡的PFP Optima MAX-XP超速離心機轉子MLA-50以100000×g分離EXO。在100000×g下兩次1小時以分離EXO。

           另外,有5個實例中的外泌體分離流程中,既使用Optima MAX-XP臺式超離轉頭,也用到SW 40 Ti (6×14 mL)、SW 41 Ti (6×13.2 mL)、Type 70.1 Ti (12×13.5 mL)、Type 70 Ti (8×39 mL)、Type 50.2 Ti (12×39 mL)和Type 45 Ti (6×94 mL) 這些配屬于Optima XPN-100、Optima-LE 80K等立式超速離心機轉頭。3.1.6 牛奶外泌體分離和3.1.8酵母菌外泌體分離純化流程即屬于此情況。

           事實上,以細胞培養基為起始材料分離外泌體流程中,使用中等容量超速轉頭會帶來極大便利。如為檢測前列腺癌患者血清中前列腺基質細胞衍生囊泡內的mRNA。研究人員從患者基質組織活檢來源細胞培養基和外周血清進行了外泌體分離。1)以細胞調節培養基為起始材料的流程中,超速離心用的是立式超速離心機Type 70 Ti角轉子、38.5mL快速密封管以100000×g離心2小時的方法。2)而1 mL患者血清樣品,是先用大小排阻色譜法分離EVs,再將所有EVs的餾分合并,轉移至5mL快速管在TLA-110角轉子中100000×g離心2小時完成的分離。


    2、Optima MAX-XP臺式超速離心機在外泌體分離應用中轉頭的使用情況

           將37個實例中所有立式超離專用的轉頭,按工作容量等效方法轉換為Optima MAX-XP臺式超離轉頭,會更便于我們直觀了解從常規樣品材料分離外泌體所用轉頭的大致情況。因臺式超離無法配置單管容量50 mL - 100mL大容量轉頭,故6×94mL的Type 45 Ti轉頭只用最大容量6×32.4mL的MLA-50替代。

    表3 外泌體超速分離中立式-臺式超離轉頭的相互替代對應表

    基礎流程1參考轉頭

    臺式超離對應轉頭

    轉頭型號

    工作參數

    轉頭型號

    工作參數

    SW 41 Ti甩平轉頭

    6×13.2 mL;28500 rpm/100000×g;k=178

    MLA-55

    6×14 mL;39100 rpm/110000×g;k=73

    SW 40 Ti甩平轉頭

    6×14 mL;28200 rpm/100000×g;k=194

    MLA-55

    6×14 mL;39100 rpm/110000×g;k=73

    SW 32 Ti甩平轉頭

    6×38.5 mL;28600 rpm/100000×g;k=228

    MLA-50

    8×39 mL;41100 rpm/110000×g;k=112

    SW 28 Ti甩平轉頭

    6×38.5 mL;27600 rpm/100000×g;k=250

    MLA-50

    8×39 mL;41100 rpm/110000×g;k=112





    Type 70.1角轉頭

    8×39 mL;36900 rpm/100000×g;k=83

    MLA-50

    8×39 mL;43000 rpm/120000×g;k=107

    Type 45 Ti角轉頭

    6×94 mL;35800 rpm/100000×g;k=167

    MLA-50

    8×39 mL;41100 rpm/110000×g;k=112

            “基礎流程1”中推薦的轉頭以Optima MAX-XP臺式超速離心機轉頭表示,得到的轉頭清單是MLA-50、MLA-55、TLA-110和TLA100.3。這說明Optima MAX-XP臺式超速離心機基本滿足常規外泌體超速分離操作所需的轉頭容量、離心力指標工作要求。

           將這37例文獻報道中實際使用的立式超速離心機轉頭轉換處理后,各轉頭的使用頻率如圖3所示。                                              

    細胞外囊泡分離應用中Optima Max-XP臺式超速離心機的轉頭報道數量統計.jpg

           統計顯示,這37個應用實例中的轉頭清單與“基礎流程1”對比后,最顯著區別在于:使用最多轉頭是MLA-55 (8×13.5mL)、TLA-55 (12×1.5mL)和MLA-50 (6×32.4mL)。

           排第二梯隊的TLA-120.2 (12×2.0mL)、MLA-80 (8×8.0mL)與TLA-100.3 (6×3.5mL),使用頻率高于TLA-110。

           MLS-50和TLS-55這兩款水平轉頭,在外泌體分離流程中應用頻率分別明顯不及同等容量范圍的TLA-120.2、MLA-80與TLA-100.3,主要原因在于這兩個水平轉頭轉速、分離效能均不如第二梯隊三個轉頭。

           如要為Optima MAX-XP臺式超離在外泌體分離應用制定應用套裝,MLA-50 (6×32.4mL)+ TLA-100.3 (6×3.5mL)無疑是一套效率靈活的組合方案。

     

    3、Optima MAX-XP臺式超離在外泌體分離中離心參數的設置

           “基礎流程1”中,外泌體沉淀操作所用的離心力有2個:100000×g或110000×g。說明這兩種離心力下4℃離心1小時所得到的外泌體組分,通??梢詽M足下游表征分析和檢測對外泌體的產量和品質的要求。

           63個應用實例中,有28例外泌體沉淀步驟設定的RCF值為100000×g,7例設置為110000×g,12例用的是120000×g(含118000×g一例),另外13例設定的RCF從130000 - 259000×g不等,另有兩例未標示RCF設置。

           “基礎流程1”離心時間要求為:在轉頭穩定地實現設定離心力指標下持續離心滿60分鐘;儀器離心時間則按不低于70分鐘來設置,以保障有效工作離心力下樣品分離時間。延長離心時間到3小時不會對外泌體結構造成損傷。

           有效離心時間與儀器離心時間設定之所以存在區別,是因所有轉頭滿負荷運行時,由靜止到加速至100000-110000×g工作狀態以及從工作轉速減速直至停止運轉,即便以最快升降速模式,則一升一降的過程耗時超過約10-20分鐘。轉頭工作轉速越高、樣品體積越大、加減速設置越平緩,轉頭啟動和剎車過程時長更長。將加減速過程所占用時間計算在內,設定的離心時間必然超過70分鐘。

           統計顯示:63個應用實例中,30.2%的項目離心時間設定為70分鐘,25.2%的實例設置為2小時,不到20%的實例用的是60分鐘時長方案(未說明原因)。達到或超過3小時設定者不到5%??梢姵^50%的實例離心時間設定范圍為70 – 120分鐘。

    表4 外泌體沉淀步驟離心時間設定值與實驗案例數統計

    超速離心時間設定值

    實例數

    70 min

    19

    120 min

    16

    60 min

    12

    90 min

    5

    180 min

    2

    75 min

    2

    80 min

    1

    240 min

    1

    其它設定時間

    NA

           “基礎流程1”中所有離心步驟全部在4℃下進行。63個實例的溫度設置情況是:28例為4℃,有3例分別為8℃(腦脊液細胞外囊泡分離)、10℃(從PVA海綿植入物中分離EVs)和25℃(小分子化合物–外泌體結合率檢測)。剩余超過半數實例未載明離心溫度條件。

    (后續:Optima Max-xp超速離心機轉頭的選擇對外泌體分離效果影響的分析)

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