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  2. 產品課堂

    雷霆收罷江海凝——Optima MAX-XP超速離心機轉頭的選擇對外泌體分離效果影響的分析

    (前續:Optima MAX-XP臺式超速離心機在外泌體分離中轉頭的運用

            術語“外泌體”本意是指細胞外囊泡EVs中直徑范圍40-150nm的小直徑顆粒亞群(sEVs)。其中既有體積大小接近的微囊泡、外泌體,也有源自不同亞細胞區室的外泌體。囊泡中內核酸含量及組成并不相同。相同RCF及時間設置下,不同轉頭類型、型號,所分離的沉淀中、150?nm, 120?nm, 100?nm和70?nm直徑囊泡的組成比例存在差異。此外,不同轉頭對顆粒直徑接近但浮力密度(浮力密度有關概念可參考《試析近垂直轉子在超速離心中的應用-下》中“2.2 NVT轉頭應用的獨特效率優勢”部分內容)分布不同囊泡群的沉淀效能不同。研究表明,用目前廣泛采用的100000-110000xg下4℃超速離心方法獲得的腦組織來源的EVs沉淀物,經進一步蔗糖或碘沙醇密度梯度離心后,可分離出多達8個浮力密度組分。
           不同轉頭及工作設置下進行的超速分離的外泌體的產量、組成和污染物含量存在不確定性。對此,早已引起學界的關注。
            要理解超速轉頭是如何影響外泌體分離效果,需要從轉頭的工作原理這一源頭說起。

    1、不同轉頭類型內部RCF分布和樣品組分沉降遷移路線的區別
    1.1 轉頭內部RCF強弱分布不同對樣品組分分離效果的影響

           做圓周運動物體所受的離心力F計算公式為:

           F = m ·ω2/r  ······················································ (1)

           公式中,ω為圓周運動的角速度,r為圓周遠動半徑。                                              

    Optima Max-xp超速離心機轉頭RCF計算原理.jpg

           離心機行業中,轉頭轉速N規定用每分鐘轉頭轉動多少圈 (ration per minute,RPM) 來表示。N轉速與轉頭角速度ω間的換算關系為

    :ω = 2π·N/60  ···················································· (2)

           由此得到轉頭離心力與離心機轉頭轉速N的計算公式:

    F = m · π2 · N2 · r/900  ···············································(3)

           業內規定用物體在離心場中的離心加速度與在重力場中重力加速度(g=9.8米/秒)的倍比值,即相對離心加速度與相對離心力場(relative centrifugation filed, RCF),來反映物體的離心作用強度,即:

    RCF = F/m · g   ···············································(4)

           將長度單位米統一轉換為厘米,可得到以下離心機轉頭RCF計算公式:

    RCF = 1.118 · 10-5 · N2 ·r(×g)  ···············································(5)

           公式(5)表明:
            1)RCF強度值與離心半徑相關
            不同轉頭Rav離心半徑不同,轉速N相同,但轉頭RCF并不相同。
            2)轉速N變化對RCF影響明顯
            轉頭轉速增加使RCF呈現指數級增長。轉速越高,轉頭內部不同位置的RCF差距更大。

    Optima MAX-XP臺式超速離心機MLA-80角轉頭內部RCF分布圖.jpg

           3)同一轉頭內部不同位置離轉軸距離不同,RCF強弱不同。
           無論角轉頭、近垂直轉頭或水平轉頭,離心機轉頭內部不同位置的RCF強度分布存在差別。通常,離心管口內側的離心半徑最小、RCF最??;管底外側的離心半徑最大故RCF最大。整體上,離心管上半部離轉軸較近,該區域RCF整體小于離心管的下半部。

    Optima Max-xp超速離心機MLA-50角轉頭內部RCF分布示意圖.jpg

           同一質點沿著離心半徑方向移動,所受離心力大小由所在位置的離心半徑決定。半徑大,所受離心力大,克服溶液內部各種阻力離心方向水平遷移的驅動力大,沉降速度快。若以離心管中心點引出的水平線為界,從管口到分界線的前半段,細胞碎片、細胞器和細胞外囊泡等樣品顆粒所處環境RCF強度整體上低于RCF設定值,故此階段沉降速度較低、對不同浮力密度小、直徑小顆粒的沉降能力效率低。越過分界線后,所處環境RCF整體高于RCF設定值,對樣品組分中密度較小、直徑較小的顆粒沉降效能增強,各種顆粒遷移速度增加,并在觸壁后沿著管壁滑降至管底Rmax位置形成沉淀混合物。
           因此,不同轉頭雖然RCF設定相同,但內部RCF強度分布不均衡、不一致。同種樣品顆粒在不同轉頭中沉降速度的變化過程是復雜的。轉頭對不同密度、直徑尺寸的顆粒沉降效能的差異是客觀存在的。這使得離心管內組成、密度和體積大小不同的樣品組分,當所承受的離心力強度與各自沉降所需離心力匹配時,將不可避免地與實驗目標樣品組分發生共沉淀。
           公式(5)還表明:轉頭的Rmax與Rmin值之間的差距大,則管內RCFmin – RCFmax間跨度大,離心管內發生共沉降的組分越復雜;轉頭Rmax與Rmin值差距越小,內部RCFmin – RCFmax跨度越小,轉頭沉淀組分則越“單純”。

    不同超速離心轉頭對不同尺寸囊泡截止效果.jpg

           研究表明,在相同RCF、離心時間設置條件下進行的細胞外囊泡沉降實驗所生成的沉淀物中,不同轉頭所沉降的的囊泡大小尺寸覆蓋范圍不同。SW 40 Ti和SW 28兩個水平轉頭的Rmax與Rmin差距大,同等離心設置下,沉淀物中囊泡的大小尺寸從25 – 300nm不等,構成復雜。而TLA-110轉頭沉淀中囊泡大小尺寸構成相對簡單,主要以50-100nm直徑的小囊泡為主。因此,而Rmax與Rmin差距的大小一定程度上,可視作樣品沉淀組分純凈度的指示器。

           在外泌體分離實驗中,若要擴大囊泡尺寸覆蓋范圍,宜采用Rmax/Rmin比值較大的水平轉頭。而要縮窄囊泡尺寸覆蓋范圍,特別是想重點關注和提高100nm直徑以下的外泌體分離純度,則垂直轉頭、近垂直轉頭和傾角更小的角轉頭比使用水平轉頭會更有效。


    1.2 轉頭類型差異決定著樣品組分遷移路徑的不同

            要實現所有組分顆粒的完全沉淀和完整回收,須等管口內側樣品顆粒遷移到管底才行。不同轉頭,樣品離心過程中沉降遷移路徑和路線長度不同。
           首先,轉頭單管的容量不同,通常適用離心管的管內徑、工作長度不同。管容量大,管長度長,樣品沉降路徑長,有效離心時間相應更長。
           其次,對比水平轉頭和角轉頭可見,管口處樣品顆粒沉降的路徑方向不同:水平轉頭內樣品遷移沉降方向始終水平指向管底。而角轉頭中樣品顆粒先是在離心力作用下水平遷移沉降,觸壁后在管壁處聚集成成更大的顆粒,隨著顆粒繼續增大和離心力沿管壁方向分力的推動下,克服管壁摩擦阻力和溶液阻力沿著管壁下沉,直至最大離心半徑處形成致密沉淀。
           不同轉頭、不同工作容量離心管中,樣品沉降路徑的差異,造成樣品沉降時間存在區別。通常認為,垂直轉頭和近垂直轉頭沉降時間較短,而角轉頭次之,水平轉頭沉降路線最長,速度最慢,用時最長。
           有效離心時間的差異,一定程度上影響到各種轉頭對樣品組分的離心產量。原因在于,離心管的前半段溶液中RCF強度較低區域,部分樣品組分因沉降速度較低,無法在設定時間內 “歸隊”而造成損失,降低了轉頭的樣品回收率。特別是外泌體沉淀重懸清洗去除蛋白污染組分步驟,采用樣品回收率更夠高的微量角轉頭、近垂直轉頭,可提高外泌體,特別是小直徑外泌體囊泡的回收率、減少損失。 

     

    2、轉頭工作容量對離心效能的影響

           轉頭工作容量影響樣品分離效能是因兩方面原因造成的。

           2.1 轉頭本身幾何結構設計因素

    表5  100000×g RCF設定條件下轉頭容量與離心效能參數列表

    轉頭型號

    工作容量

    離心管尺寸

    工作轉速

    Rav

    Rmin

    沉降距離

    RCFmin

    K因子

    TYPE 100 Ti

    8×6 mL

    φ3×64 mm

    40200 rpm

    55.5 mm

    39.7 mm

    31.9 mm

    71790 ×g

    37.3

    TYPE 90 Ti

    8×13.5m L

    φ16×76 mm

    40200 rpm

    55.4 mm

    34.2 mm

    42.3 mm

    61840 ×g

    56.0

    TYPE 70 Ti

    8×39 mL

    φ25×89 mm

    36900 rpm

    65.7 mm

    39.5 mm

    52.4 mm

    60180 ×g

    83.5










    SW 55 Ti

    6×5 mL

    φ13×51 mm

    32600 rpm

    84.6 mm

    60.8 mm

    47.7 mm

    72300 ×g

    81.0

    SW 41 Ti

    6×13.2 mL

    φ14×89 mm

    28500 rpm

    110.2 mm

    67.4 mm

    85.7 mm

    61260 ×g

    178.4

    SW 40 Ti

    6×14 mL

    φ14×95 mm

    28200 rpm

    112.7 mm

    66.7 mm

    92.1 mm

    59350 ×g

    194.3

    SW 32 Ti

    6×38.5 mL

    φ25×89 mm

    28600 rpm

    109.7 mm

    66.8 mm

    85.7 mm

    61140 ×g

    228.3

           表5中的RCFmin代表在100000×g RCF設定下,轉頭最小離心半徑處對應RCF。

           數據顯示,無論是角轉頭還是甩平轉頭,轉頭單管容量從4mL增至39mL,轉頭Rmin變短的同時樣品沉降距離變長,RCFmin降低和轉頭K因子值增大。RCFmin下降和樣品沉降距離加長,使得有效離心時間要相應延長。否則,樣品回收率要降低。

           在外泌體分離實驗中排空培養基自帶外泌體的環節,培養基體積大,所用轉頭單管容量(50-100ml)、轉頭整體樣品容量也大,外泌體排空的離心時間越長。大量應用實例中,這一過程的離心時間長達15-18小時。而到外泌體沉淀階段,樣品體積不過2mL,相同RCF和溫度設置,只需70min-2小時即可完成。因此,離心機條件許可情況下,優化培養基外泌體排空轉頭的選擇,有利于提高效率和實驗流程優化。


    2.2 離心管樣品裝載體積的影響

           同一超速離心轉頭適用的多種不同額定容量圓底離心管,當管徑一致時,則容量差異源于管長度的不同。將樣品管載入轉頭時,通過添加相應管帽適配器,既為管頂部提供安全支撐,又確保離心管與離心孔底部的緊貼。

           以Optima MAX-XP臺式超速離心機的MLA-55角轉頭(55000rpm/8×13.5mL)為例。它可使用容量范圍、管徑、長度、材質和款式不同的多款超速離心管,包括:

           13.5mL超凈圓頂熱封管(344322,φ16×76 mm)

           13.5mL薄壁超凈開口管(344085,φ16×76 mm);

           10mL厚壁透明開口管(355630,φ16×76 mm);

           10.4mL帶蓋透明離心瓶(355603,φ16×76 mm);

           10mL鐘頂熱封管(344622,φ16×67mm);

           8.9mL指封管(361623,φ16×60mm);

           6.3mL g-Max快封管(345830,φ16×44 mm)

           4.2mL g-Max熱封管(356562,φ16×38 mm);

           6.5mL薄壁超凈開口管(344088,φ13×64 mm)

           4mL厚壁透明開口管(355645,φ13×64 mm);

           2mL薄壁超凈開口管(344091,φ8×49 mm)。

           其中,6.5mL薄壁超凈開口管、4mL厚壁透明開口管和2mL薄壁超凈開口管三種管徑小于轉頭額定16mm直徑標準,使用中須在管外加配管套適配器。單管套適配器的添加,使離心管中心整體上向內、向上偏移后,遠離了轉頭最大離心半徑(Rmax)位置和最強RCF區域,造成樣品整體RCF降低,離心效能下降。

    Optima MAX-XP臺式離心機的MLA-55角轉頭使用不同類型離心管時的離心效能.jpg

           而6.3mL g-Max快封管、4.2mL g-Max熱封管則不同。其管身外徑與標準13.5mL管一致,使用時無需添加管套適配器。在管帽安裝到位后,離心管底部始終緊貼離心孔的外壁和底部,管身整體上處于轉頭RCF最大區域。其樣品分離效能自然高于使用管套適配器的離心管。此外,其管身短,樣品組分沉降路徑長度短,離心時間短。因此,g-Max管分離效能高于8.9 – 13.5mL標準尺寸和容量的離心管,實現少量樣品在高轉速、高K因子值而容量較大的轉頭中離心,充分利用優勢資源,并極大提高離心效能。

           同理,容量相同時,厚壁開口管離心效能不及薄壁開口管和g-max管的工作成效。

           Beckman轉頭“大魚吃小魚”式設計優勢在于,當無法獲得參考文獻中所使用的同款轉頭時,通過用速度較高、容量較大的轉頭配合小容量離心管使用,并優化RCF設置和離心時間設置,同樣能獲得理想的樣品分離效果。

     

    3、轉頭固定傾角大小與轉頭離心效能的關系

           固定傾角大小影響的是角轉頭和近垂直轉頭的分離效能。

           沉降離心時間的計算公式為:

    Ts = (1/S)×2.54×1011×1/N2×ln(Rmax/Rmin)  ···················································· (6)

           式中S代表特定樣品組分在特定溫度、溶液條件下的沉降系數。N為工作轉速。當轉頭Rav相同或接近時,離心時間長短與Rmax/Rmin比值之自然對數值正相關。轉頭的傾角大,則Rmax/Rmin,Ts相應也大。

           此外,相同離心管安裝于大傾角轉頭中時,離心管整體向轉軸方向傾斜,管的上半部整體RCF小于傾角較小轉頭且樣品水平沉降距離增大。故相同離心時間內,大傾角轉頭的離心效能低。

     

    4、轉頭K因子值的基本概念與運用

           轉頭K因子(k-factor)又稱k 系數,是業內為表征轉頭離心效能人為賦予的參數。它源于人們對樣品在特定轉頭中最短離心時間的計算過程。

           對于特定轉頭,Rmax/Rmin比值是固定的。當轉速N取轉頭最高轉速時,則2.54×1011×1/N2×ln(Rmax/Rmin)為一常數,人們將這一常數規定為k因子,即:

    K = 2.54×1011×1/N2×ln(Rmax/Rmin)   ···················································· (7)

           公式(7)表明:轉頭k因子值與工作轉速、Rmax/Rmin有關。無論是因工作轉速Neff降低或因轉頭Rmax/Rmin比值上升,均造成轉頭離心效能下降同時K因子值增大。而k因子值降低則宣示了轉頭離心效能提高。

           若規定Keff代表工作轉速Neff時的k因子值,K為轉頭最高轉速N時k因子值,可得到keff 、K間換算公式:

    keff = K×N/Neff    ···················································· (8)

           這表明:轉頭工作轉速高則k值低,轉速降低則k值升高。

           對于特定型號轉頭,ln(Rmax/Rmin)是固定的,因此,確定了工作轉速,就相當于確定了keff值。

           而根據轉頭的k因子值,即可評估轉頭離心效能高低(見表6)。 

    表6 100000×g RCF值條件下超速離心轉頭工作參數

    轉頭型號

    工作轉速

    Rav

    Rmin

    Rmax

    RCFmin

    轉頭角度

    K有效因子值

    離心效能高低

    TLA-120.2

    53100 rpm

    31.8mm

    24.5mm

    38.9mm

    77300 ×g

    30°

    18.1

    TLA-100.3

    48600 rpm

    37.9mm

    27.5mm

    48.3mm

    72680 ×g

    30°

    28.8

    MLA-130

    46200 rpm

    41.9mm

    29.9mm

    53.9mm

    71400 ×g

    35°

    24.5

    TLS-55

    38800 rpm

    59.4mm

    42.2mm

    76.5mm

    71090 ×g

    NA

    70.9

    較高

    MLA-55

    37400 rpm

    64.0mm

    45.0mm

    84.5mm

    70430 ×g

    35°

    77.9

    較高

    TLA-110

    49100 rpm

    37.2mm

    26.0mm

    48.5mm

    70140 ×g

    28°

    29.1

    Type 50.2 Ti

    33200 rpm

    81.2mm

    54.4mm

    107.9mm

    67000 ×g

    24°

    103.9

    中等

    MLS-50

    35300 rpm

    71.7mm

    47.5mm

    95.8mm

    66230 ×g

    NA

    100.6

    中等

    MLA-80

    44300 rpm

    45.7mm

    29.5mm

    61.9mm

    64780 ×g

    26°

    52.4

    較高

    TLA-55

    47300 rpm

    40mm

    25mm

    55mm

    62580 ×g

    45°

    76.7

    較高

    SW 41 Ti

    28500 rpm

    110.2mm

    67.4mm

    153.1mm

    61260 ×g

    NA

    178.4

    較低

    Type 70 Ti

    36900 rpm

    65.7mm

    39.5mm

    91.9mm

    60180 ×g

    23°

    83.5

    較高

    MLA-50

    39200 rpm

    58.4mm

    33.6mm

    83.2mm

    57770 ×g

    30°

    117.3

    中等

           數據顯示,相同樣品條件和相同100000×g RCF設置下,分離效能最佳的前5個轉頭為清一色Optima MAX-XP臺式超速離心機適用轉頭,從高到低分別是:

           TLA-120.2(12×2.0mL)

           TLA-100.3(6×3.5mL)

           MLA-130(10×2.0mL)

           TLA-110(8×5.1mL)

           MLA-80(8×8.0mL)


    5、根據轉頭工作效能確定外泌體超速離心分離的解決方案

           離心機驅動控制系統是以轉頭平均半徑(Rav)作為有效離心半徑,采用公式(5)的原理自動計算特定轉速的RCF值,或依據實驗者設定的RCF值計算并控制轉頭工作轉速的。轉頭的分離效能,受離心半徑、傾角大小、樣品容量和離心管的選擇等多重因素制約。僅僅關注FCR設置值大小,不足以有效、全面評估轉頭的離心效果。
           就外泌體分離實驗而言,轉頭選型方案對外泌體的提取產量、品質和離心時間長短都有直接影響。在轉頭的選擇和特定轉頭工作參數的優化調整上,可參考以下原則:
    5.1 根據研究側重點選擇最適宜的轉頭
           當研究目標為整個細胞外囊泡群的構成及動態變化規律時,采用Rman/Rmin比值較大的水平轉頭或大角度角轉頭較為有利。當研究主要對象為中小直徑囊泡時,則Rman/Rmin比值較小的垂直轉頭、近垂直轉頭及傾角相對較小的角轉頭是首選。
           要縮短外泌體離心操作流程所需時間,Rman/Rmin小比值類轉頭無疑較為理想。
           而針對外泌體密度梯度純化分離,在時間條件允許時,單管容量3.5 – 13.5mL的水平轉頭或角轉頭都可以考慮。


    5.2 根據自身轉頭條件優化調整離心參數
           外泌體超速分離中, RCF值設定明確后,為確保溶液中樣品回收率和離心效率,對Rmin小的轉頭宜適度延長離心時間。同理,若采用相同離心時間設置,可優先嘗試將Rmin較小轉頭的RCFmin適度提高,達到兩種轉頭的RCFmin值接近的效果?;蛘咭雊-max管,確保樣品的RCF環境趨于接近。
           以單管容量均為39mL的MLA-50與Type 70 Ti兩個轉頭為例:Type 70 Ti的Rmin和RCFmin大、K因子值小,故分離效能高于MLA-50。如參考方案是Type 70 Ti轉頭100000×g下離心70分鐘設置,則多半采用了快速升降速模式設置。要用MLA-50轉頭來替代,則離心時間應適度延長。反之,若參考方案為MLA-50轉頭,而須用Type 70 Ti轉頭進行,則延長離心時間不必延長。

     (后續:Optima MAX-XP臺式超速離心機在外泌體分離操作中時間的設定

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