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  2. 百家秘籍

    撥開云霧見月明——英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術特點解析-1

           Invitrogen iBright FL1500, 是美國賽默飛公司2019年上市的一款主要針對Western Blot免疫印跡多色熒光檢測應用而推出的多功能成像分析系統。它隨機標準配置包括l藍綠色LED透射儀、SDS-PAGE染色凝膠白光屏(White trans-illuminator screen)、熒光濾光片套件、印跡參考樣品(iBright Imaging System Sample Blot / Reference target)、安全防護眼鏡(Safe Imager Viewing Glasses)和PC端iBright Image Analysis Software。既支持熒光印跡(一張印跡膜上可同時檢測綠色、橙色、紅色、遠紅外和近紅外5種熒光)、HRP和AP底物的化學發光印跡和顯色法(如Ponceau S、MemCode染色)蛋白印跡成像檢測,還可用于熒光染色、顯色和染色的核酸、蛋白質凝膠的成像分析。

           在Western Blot多功能成像分析領域, Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System (1708280,2013)/ChemiDoc MP Imaging System (12003154,2020)、GE Amersham Imager 600 RGB(AI600, 2014)/ ImageQuant 800 Fluor(AI800, 2019)、UVP ChemStudio Plus Imaging Systems(2013)等老牌強手環伺左右,此時Invitrogen iBright FL1500的入場,略顯得姍姍來遲。  

    iBright FL1500 Western熒光成像分析儀.jpg

           據阿拉斯加科技2022年10月完成的一項調查顯示:從2013年11月-2022年10月,以“ChemiDoc MP[Text Word]”為檢索條件在PubMed期刊數據庫共查到52篇article。而以“iBright [Text Word] AND FL1500 [Text Word]”作關鍵詞檢索,共獲得152條記錄。

           業界流行“后發優勢”一說。那iBright FL1500在吸收了“前輩”的技術精華后,到底煉就何等吸“睛”大法,逆襲躋身強林的?為此,我們推出《撥開云霧見月明——英捷iBright FL1500 Western熒光成像分析儀技術特點解析》系列文案,從硬件配置到軟件模塊4個角度,對iBright FL1500進行剖析,以期我們對該產品為代表的Western熒光成像分析儀、連帶Western ECL成像系統有更深入的了解。

    一、多功能熒光檢測應用

           對上述使用iBright FL1500 Western熒光成像儀實施檢測的152個應用實例,按檢測樣品類型分類統計結果顯示:

    表1  iBright FL1500 Western熒光成像儀檢測應用舉隅

    樣品類型

    案例數

    應用實例

    ECL Blot檢測

    123個

    Dot-Blot分析

    常規mini PVDF 發光

    熒光Blot檢測

    13個

    FI of CM-Dil dye measured on nitrocellulose membrane

    Alexa Fluor 488-labeled secondary antibodies

    Membranes probed with Alexa Fluor 680-labeled and Alexa Fluor 488-labeled secondary antibodies

    Fluorescent Blot (Alexa Fluor 488, 647, and 800)

    蛋白熒光凝膠檢測

    5個

    fluorescent 12% SDS-PAGE gels (Ex488nm/Em 526nm);

    4%–15% Mini-P TGX Precast Protein gel fluo assay

    核酸熒光凝膠檢測

    8個

    cross-linked RNA Gels stained with SYBR Gold

    agarose gel stained with Gel Red

    agarose RFLP analysis

    TAE agarose gel stained with ethidium bromide (EB)

    其他樣品檢測應用

    4個

    SD plate imaged using the TexasRed filter set

    Gelatin-LB Plate Fluorometric Substrate Assays

    TLC silica gel 60G plate可見光檢測

            表1信息表明,iBright FL1500 Western熒光成像儀應用實例中,80%屬于化學發光Blot檢測(enhanced chemiluminescence Blot,ECL);熒光測定類應用的占比不足20%,主要包括蛋白Blot、熒光標記蛋白凝膠、熒光標記核酸凝膠和微生物克隆板熒光檢測。20%的比例雖不算高,但足以證明樣品熒光類應用不可或缺。

           凝膠成像分析儀(如Bio-Rad GelDoc Go、Axygen GDBL-1000)和多數印跡化學發光系統(如Bio-Rad ChemiDoc、ChemiScope 6100BZChemiScope 6200),標配通常是302nm波長紫外透射光源,無法激發Cy5(Ex 649nm,Em 670nm)、Cy3(Ex 552nm,Em 570nm)、SYPRO Orange(Ex 470nm,Em 570nm)等凝膠熒光染料,或激發SYBR Green(Ex 498nm,Em 522nm)、SYBR Gold(Ex 490nm,Em 540nm)、Gel Green(Ex 500nm,Em 530nm)難以達到最佳分析效果。最關鍵的是,Western ECL成像儀缺少特異性熒光濾光組件,而凝膠成像儀則熒光濾鏡、冷CCD都缺失,因此,都無法勝任微弱熒光信號的采集。

           因此,既配置有透射紫外(Trans-UV)和(或)透射藍光(Trans-blue)激發光源,又擁有多組特異性熒光激發-發射濾光組件和冷CCD的Western熒光成像分析儀,自然成為SYPRO Orange、SYBR Gold等熒光染料標記凝膠樣品檢測的理想方案。

    表2 主流品牌Western多功能成像分析系統熒光檢測模塊配置表

    品牌

    Bio-Rad

    GE   Amersham

    UVP

    Invitrogen

    型號

    ChemiDoc MP

    (12003154)

    ImageQuant 800 Fluor

    ChemStudio Plus

    iBright FL1500

    CCD單元

    -30℃ Cooled CCD

    610萬像素

     

    -25℃制冷CCD

    830萬像素

    F 0.74

    -57℃制冷CCD

    810萬像素

    f/0.95

    制冷CCD

    910萬像素

    F 0.95

    凝膠熒光激發光源

    Trans-UV 302nm

    (SYPRO Ruby/Gel Red/EB)

    Trans-UV 312nm

    Trans-UV 302nm

    NA

    Trans-blue 450–490nm(可選)

    (SYBR Gold/SYBR Green/Gel Green

    /GFP/SYPRO Orange)

    NA

    Blue LED Trans-illuminator (可選)

    Blue Converter Plate 460-470 nm

     (可選)

    Trans-UV 480nm

    印跡熒光激發濾片

    Epi-blue 460–490nm

    Epi-LED 460nm

    Epi-LED blue

    ?Epi-LED 455-485nm

    Epi-green 520–545nm

    Epi-LED 535nm

    Epi-LED green

    Epi-LED 515-545nm

    Epi-red 625–650nm

    Epi-LED 635nm

    Epi-LED red

    Epi-LED 608-632nm

    Epi-far red 650–675nm

    Epi-LED 660nm

    NA

    Epi-LED 610-660nm

    Epi-near IR 755–777nm

    Epi-LED 775nm

    NIR(可選)

    Epi-LED 745-765nm

    熒光檢測濾片

    Em 518–546nm (SYBR Gold)

    Em 525BP20nm

    (Cy2)

    Em 510-560 nm

    (SYBR Green)

    EM 508-537nm

    (Alexa Fluor 488)

    Em 577–613nm

    (Alexa555/Cy3/SYPRO   Orange)

    NA

    Em 520-620 nm

    (SYBR Gold)

    EM 568-617nm

    (Alexa Fluor 546/EB)

    Em 590/110nm (EB/SYPRO Red)

    Em 605BP40nm

    (Cy3/EB)

    Em 580-630 nm

    (Deep   Purple/EB/RFP)

    NA

    Em 675–725nm (Cy5)

    Em 705BP40nm

    (Cy5)

    Em 668-722nm(可選)

    (Alexa633/Cy5)

    EM 675-720nm

    (Alexa Fluor 647)

    Em 700–730nm (IRDye 680)

    Em 715BP30nm

    (IR short)

    Em 700-740nm(可選)

    (IRDye 680/CF 680)

    Em 710-730mn

    (Alexa Fluor 680)

    Em 813–860nm (IRDye800)

    Em 836BP46nm

    (IR long)

    Em 780 nm long pass

    (Alexa750) (可選)

    Em 800-850nm

    (Alexa Fluor 790)

            Western熒光成像分析儀,顧名思義,是可用于單重(singleplex)或多重(multiplex)熒光標記印跡的圖像采集與分析。熒光印跡檢測技術(fluorescent Blot)比ECL印跡分析法究竟有何技術優勢?我們認為,熒光蛋白印跡檢測的優勢主要是“三高”,即高特異性、高效率和高分辨力。

    1、熒光Blot檢測的高特異性

           幾乎所有原核和真核細胞樣品,在熒光檢測過程中都不同程度地存在與檢測信號無關的自發熒光。樣品內源成份(如組織細胞結構組成成分和代謝物)、樣品處理中引入的外源物質(如組織固定所用的多聚甲醛等)和樣品所用器材(如試劑和轉印膜),都可能助長這種背景熒光信號。其中一些組分無需激發光誘導即可產生自發熒光,如作為細胞外基質主要成分的膠原蛋白(Em 350-450 nm),細胞內核黃素(Em 550 nm),動物及細菌樣品中的維生素A(Em 500 nm)等。
            紅藍綠色自發熒光的存在,連同電泳、轉印過程的誤差,往往使ECL法印跡圖像背景增強,Blot條帶-背景反差削弱,檢測信噪比(S/B)降低。當然,自發熒光與測試熒光基團的光譜如存在重疊,則背景熒光同樣會干擾樣品熒光Blot分析,降低測試靈敏度和準確性。

           熒光印跡分析依托熒光濾光片組件和低溫冷CCD檢測器進行。帶寬優化光學濾片,可將激發光源、樣品和印跡膜自發熒光等高效濾除,只允許波長特異性熒光信號進入CCD,Blot圖像中背景信號被極大削弱。

    iBright FL1500多通道熒光Blot圖像及疊加后效果.jpg

    (上圖:通過多個熒光通道獲取的熒光圖像及疊加后效果;下圖:用iBright FL1500采集的ECL Blot條帶成像后再手工合并圖像)

    iBright FL1500采集的ECL Blot檢測圖像.jpg

           對比熒光Blot和用于發表的ECL印跡(原圖經反相轉換成經典放射性自顯影底片的效果)圖像,不管是添加偽彩色的多色熒光疊加圖還是單色熒光圖,熒光Blot圖像都顯得更背景更“干凈”,條帶與背景對比反差更大。一張圖上可呈現所有檢測對象。
           圖像的基礎背景低,條帶定量分析時,條帶信號經背景扣除處理后所保留的有效值更高,對弱信號條帶檢測分辨力的提高極為有利。

    2、熒光Blot檢測的高分辨力

           蛋白質磷酸化修飾和去磷酸化,是調控信號轉導、基因表達及細胞的增殖分化等生理病理過程啟動的一個重要分子開關。通過檢測蛋白質磷酸化,了解特定蛋白質在細胞受到多種生物和非生物脅迫刺激時的磷酸化水平變化情況,有助于理解蛋白質在其中所發揮的調控功能和內在機制。

           Western Blot 與ELISA、激酶活性分析及質譜,都是檢測蛋白磷酸化狀態的常用方法。蛋白經SDS-PAGE分離并轉移到膜上,采用磷酸化特異的抗體可精確識別蛋白磷酸化氨基酸位點,實現對蛋白磷酸化水平的定性、定量分析。

           因磷酸化修飾所引起蛋白分子量變化非常微小,磷酸化及非磷酸化兩種不同狀態的蛋白,經凝膠分離后的條帶往往緊貼、重疊,這給ECL化學發光標記法區分這兩種蛋白組分帶來難以克服的困難。而此時,Western多色熒光檢測技術則正好可以大顯身手。

    iBright FL1500 Multiplex熒光Blot檢測圖像.jpg

          如圖所示,原本空間位置相互重疊的MAPK信號通路ERK家族成員,ERK1/2(p44/42)總蛋白和發生磷酸化修飾的ERK1/2(Phospho-p44/42),分別經自特異性一抗錨定,再采用DyLight 800、StarBright B700兩種不同的熒光基團標記的二抗檢測,借助于兩個熒光通道,分別采集到出紅色(磷酸化修飾的ERK1/2)、綠色(ERK1/2總蛋白)兩種信號。兩個通道的圖像經疊加可見,在圖像同一個位置,同時呈現出紅色、綠色和紅綠復合形成的黃色信號窄帶。疊加圖上紅、綠兩種信號的條帶邊界重疊難以分辨,但在不同熒光通道內,各條帶邊界則清晰分明,為分析各條帶提供了極大便利。

          而目前已知的蛋白翻譯后修飾方式多達20種以上,除磷酸化,乙?;?、泛素化、甲基化也都屬常見蛋白修飾方式并參與機體多樣化生命過程調控。使用多重熒光印跡檢測技術,研究人員用3-4個熒光基團標記多種蛋白質,每種蛋白質的檢測信號在不同熒光通道中采集,從而達到在同一印跡上一次檢測多種蛋白質(不受蛋白間的分子量大小的影響),可區分在復雜生物學調控路徑中各蛋白的角色定位。操作過程無須裁膜、無須逐一剝離蛋白組分,簡便高效。

    3、熒光Blot檢測的高效性

          Western熒光成像分析系統所配置的熒光檢測通路,決定了印跡可同時分析的目標蛋白的種數和印跡檢測所適用二抗熒光基團的光譜屬性。

          表2信息顯示,主流品牌型號的熒光通道配置數量、濾光片光譜截止范圍雖有一定差異,但可發現以下共同點:

          1)綠色熒光通路(Em525/BP20nm):適用于SYBR Gold、SYBR Green、GelSafe等;
          2)橙黃色熒光通路(Em605/BP40nm):適用于Cy3/SYPRO Orange/Alexa Fluor 546/EB等;
          3)紅色熒光通路(Em705/BP40nm):適用于CY5/Alexa Fluor 647等;
          4)遠紅外(FIR)熒光通路(Em715/BP30nm):適用于IRDye 680/Alexa Fluor 680等;
          5)近紅外(NIR)熒光通路(Em836/BP40nm):適用于IRDye800/Alexa Fluor 790等。

          目前主流Western熒光成像分析儀的熒光檢測通路配置數量普遍高于2012-2013年版機型。譬如,2012版ChemiDoc MP Imaging System為3熒光通道(6位濾光片輪,預留1個空位用于化學發光檢測,1個標準顯色/白光濾片,外加綠530nm、紅605nm、深紅695nm三組熒光濾片)。2013版Amersham Imager 600 RGB設置的也是綠Cy2 (525BP20nm)、紅Cy3/EB (605BP40nm)、深紅Cy5 (705BP40nm) 三個通道。而2019版上市的ChemiDoc MP、Amersham ImageQuant 800(AI 800)和iBright FL1500,均采用了8位濾光片輪,熒光通道數量擴充至5個。

    iBright FL1500多色熒光通道配置.jpg

          熒光檢測通道數量和適用光譜種類的增加,帶來至少2方面的便利。

          首先,由于樣品自發熒光多集中在藍色、綠色和紅色的可見光(波長380-700nm)范圍,新增的遠紅外、近紅外外熒光檢測通道,基本避開電泳樣品中其它生物分子和轉印膜自發熒光的背景干擾,使獲得更高圖像信噪比成為可能。

          其次,熒光通道增加,使得多通道熒光應用的組合更靈活。

          以iBright FL1500為例,熒光發射端共設置了Em1:508-537nm(Alexa Fluor 488) 、Em2:568-617nm(Alexa Fluor 546) 、Em3:675-720nm(Alexa Fluor 647) 、Em4:710-730mn(Alexa Fluor 680) 和Em5:800-850nm(Alexa Fluor 790)共5個通道。

          預留一個通道用于內參蛋白信號檢測,再從檢測光譜存在明顯重疊的Em3 (675-720nm)和Em4 (710-730mn)中2選1后,iBright FL1500可以同時對采用Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 647和Alexa Fluor Plus 800標記四種蛋白同時檢測。

          Em3、Em4兩個通道的檢測光譜存在一定程度的重疊,而熒光染料存在主、次激發峰。當中一個通道測試時,另一種染料的次激發效應信號也同時被主檢測通道捕獲。這樣使數據分析的邏輯出現混亂:原已被分離的兩個蛋白,竟都包含有另一種蛋白信號。而事實上純屬光學通道間信號竄擾(cross-talk)所致。因此,兩個存在光譜重疊的檢測通道,在一次測試中只能用其中一個以杜絕信號竄擾現象。這樣一來,Western Blot成像分析儀雖配置有5個通道,實際卻只能同時使用4個通道。此現象不僅存在于iBright FL1500系統,同樣也能在新版ChemiDoc MP和ImageQuant 800 Fluor上觀察到。

          還須注意的是,就Western印跡多色熒光分析實驗而言,5通道配置系統實際可同時檢測的蛋白最多只能達到3種(如內參β-actin+pAKT+AKT三種熒光同時檢測模式)。這是因為嚴格的Western Blot實驗還需要進行TPN處理,而總蛋白的測定通常需占用一個檢測通道。

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