<b id="mvb0n"><p id="mvb0n"></p></b>
<blockquote id="mvb0n"></blockquote>
    <source id="mvb0n"><track id="mvb0n"></track></source>
    <b id="mvb0n"></b>
  1. <progress id="mvb0n"></progress>
    <b id="mvb0n"><acronym id="mvb0n"><bdo id="mvb0n"></bdo></acronym></b>

  2. 百家秘籍

    外泌體差速離心分離流程中的低溫高速離心機配置要求

           目前全球廣泛使用的外泌體超速離心(differential centrifugation, DC)分離法基礎操作流程,源于法國居里研究所G. Raposo、A. Clayton等2006 年發表的《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》。文中詳細描述了從細胞培養上清液和生物體液中分離外泌體的 基礎操作流程1(參考《外泌體超速離心分離法基礎操作流程1 (譯稿)》)。
            基礎操作流程1給出的超速離心全過程主要分為三個步驟:

    步驟1:連續4℃低速(300×g,10分鐘)、中速(2000×g,20分鐘)離心,依次除去活細胞、死細胞碎片及樣品中的其它有形細小顆粒;

    步驟2:4℃下10000×g離心去除體積較大的微囊泡及凋亡小體;

    步驟3:4℃下100000×g離心沉淀外泌體組分并除去與之共沉淀的蛋白質等雜質。

           實際應用中,因初始提取樣品材料類型、體積不同,加之不同實驗條件不一,樣品的高速離心處理環節,具體細節往往存在差異。在此,我們對基礎流程1中超速分離前的低溫離心流程綜合考慮,對其中所需的離心機性能和轉頭配置要求加以探討。

           ISEV調查結果顯示,分離EVs所用初始樣品中,血漿體積通常在5mL以內,尿液為5-100mL,有25%受訪者實驗所用細胞培養基>100mL,所用培養基體積5-100mL的實驗近50%,腦脊液和牛奶起始體積5-100mL,來自復雜基質樣品、非哺乳動物來源的樣品體積少于1mL。

     細胞外囊泡分離常用起始樣品材料類型及體積.jpg

           對起始材料離心,既要保證效率又要避免材料在離心容器中的損失和污染,則低溫離心機配置應滿足以下要求。

    1. 單管容量

           單管容量應覆蓋1.5mL – 100mL范圍,以1.5mL – 250mL范圍最佳。其中應包括1.5mL、10mL圓底管、15mL尖底管、50mL尖底管、100mL圓底管、200mL尖底管和250平底離心管/瓶配套適配器和(或)輔助墊片附件。

    2. 轉頭配置

           10 - 250mL容量離心管/瓶用于2000×g以下低速離心沉淀細胞和微小顆粒;

           1.5– 50mL高速角轉頭用于10000×g-20000×g階段大囊泡、凋亡小體的沉淀。

           考慮到尖底離心管、錐形離心瓶生成沉淀后轉移上清操作的便利,高速角轉頭中可優先考慮能直接離心15mL/50mL尖底管的高速角轉頭,如Beckman JA-12尖底管角轉頭(12×50mL/12000rpm/23200×g)、Thermo F15-8×50cy(8×50mL錐形管/ 14500rpm/RCF 24446×g)、F13-14×50cy(14×50mL錐形管/10000rpm/RCF 17105×g)。其次是50-100圓底管高速角轉頭,如Thermo F15-6×100y轉頭(6×100mL/15000rpm/RCF 24652xg)、Highconic II角轉頭(6×94mL/10350rpm/RCF 15090×g,PN75003620)、eppendorf F-34-6-38角轉頭(6×85mL /11000rpm/RCF 15550×g)、Beckman JA-18(10×100mL /18000rpm/47900×g)、JA-25.50(8×50mL/25000rpm/75600×g)和S-13.1高速水平轉頭(6×50mL/13000rpm/RCF26500×g)。

           須注意:外泌體分離流程中所需的RCF值應理解為轉頭平均半徑處RCFav,而非產品資料中標示的該轉頭在最高轉速下產生的最大RCFmax。因此,凡轉頭標示最大RCF為10000 - 12000×g角轉頭、水平轉頭,如其RCFav根本無法達到10000×g離心要求。

    S0410水平轉頭工作性能參數.jpg

           以圖中Beckman S40410水平轉頭為例,額定最高轉速10000rpm時,轉頭最大離心力為10733×g,但此時轉頭內部的平均離心力僅為6826×g。Thermo HighConic III 錐形管角轉頭(最高轉速9500rpm/RCFmax 12108×g)、Allegra X-30R使用F0685定角轉頭(6×85mL/最高10000rpm/RCFmax 10864×g)都存在相同現象。

    3. 離心機機型

           既滿足300×g - 2000×g離心,又能適應10000×g高速沉降要求的低溫離心機,可首選相對經濟的中等容量臺式低溫高速離心機,如Thermo Multifuge X1R Pro、Sorvall ST1R Plus、eppendorf 5804R等。

           實驗條件許可, Beckman Avanti J-E、Avanti J-26 XP、Avanti JXN-26Avanti JXN-30Himac CR -22N等立式低溫高速離心機亦無不妥。如3.1.1.4 培養細胞外泌體結構與質譜分析項目中,用到Beckman Avanti J-J26XP立式低溫高速離心機JA 25.15高速角轉頭(25000rpm/24×15mL)對去除細胞碎片后的上清12500×g、40 min、4℃離心去除體積較大的mEVs、lEVs后再進行超速沉降外泌體。

    97精品永久性无码_久久99中文字幕人妻_亚洲无码一级片在线播放_久久久黄色小视频
    <b id="mvb0n"><p id="mvb0n"></p></b>
    <blockquote id="mvb0n"></blockquote>
      <source id="mvb0n"><track id="mvb0n"></track></source>
      <b id="mvb0n"></b>
    1. <progress id="mvb0n"></progress>
      <b id="mvb0n"><acronym id="mvb0n"><bdo id="mvb0n"></bdo></acronym></b>