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  2. 百家秘籍

    從PubMed數據看Beckman超速離心機Type 45Ti轉頭的配置與應用——外泌體的分離

    (前續:Type 45Ti轉頭在蛋白分離中的應用) 

    二、Beckman Type 45Ti角轉頭在細胞外囊泡離心分離中的應用

          在細胞外囊泡(EVs)離心分離應用是近10年來Type 45Ti角轉頭有關高分實驗文獻井噴的重要推手(有關技術問題可參考阿拉斯加科技發布的《外泌體超速離心分離法基礎操作流程1 (譯稿)》、《Optima MAX-XP臺式超速離心機在外泌體分離中應用的主要類型》等文)。

          Type 45Ti角轉頭額定最高轉速45000rpm, 轉頭內部RCFav 158000 ×g。其RCF指標符合基礎操作流程1推薦RCF要求。而轉頭工作容量6×94mL, 離心處理樣品容量達420-550mL, 很好地適應了培養基自帶外泌體顆粒排空所需的較大體積要求, 便于高效完成調節培養基的準備。

          EVs差速離心分離法, EVs回收率不高, 對起始樣品材料的體積有一定要求。而Type 45Ti轉頭單管容量大, 可同時勝任中大體積培養基樣品的高速、超速離心沉兩個環節的操作。

          此外, Type 45Ti轉頭通過添加相應適配器后, 可兼容4-94mL容積范圍各種常用超速離心管, 可根據實際樣品體積大小和分離技術要求, 靈活選擇所需的超速離心管款式與規格。

          因此, 在以細胞培養基為初始樣品來源的細胞外囊泡, 主要是小細胞外囊泡——外泌體的提取分離中, 深受歡迎。我們通過兩個代表性實例來了解其使用方法。

    實例1:巨噬細胞EVs炎癥控制功能研究(Tuan Anh Phu, 2023)

          巨噬細胞載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)的表達可以調節microRNA控制的NF-κB信號傳導通路, 被認為在調節細胞炎癥和組織修復特性中起核心作用。而研究證實, 巨噬細胞產生的細胞外囊泡(EVs)可以差異地控制受體細胞的炎癥特性。ApoE的表達與EVs介導的細胞信號傳導通路之間的相互關系并不清除。

          通過源自對野生型小鼠骨髓的巨噬細胞(WT-BMDM)、ApoE缺陷型小鼠骨髓的巨噬細胞(EKO-BMDM)分布產生的兩種細胞外囊泡WT-BMDM-EV、EKO-BMDM -EV 的對比研究顯示:WT-BMDM-EV通過增加細胞 apoE 和 miR-146a-5p 水平, 從而減少 NF-κB 信號傳導, 將抗炎特性傳達給受體骨髓細胞。同時, 還下調了受體骨髓細胞miR-142a-3p的水平而導致CPT1A水平升高, 改善受體細胞中的脂肪酸氧化(FAO)和氧化磷酸化(OxPHOS)。實驗證實, 將WT-BMDM-EV輸注到高脂血癥小鼠中可以解決炎癥。相比之下, EKO-BMDM-EV 通過降低 apoE 和 miR-146a-5p 的細胞水平發揮相反的作用, 增加 NF-κB 驅動的 GLUT1 介導的葡萄糖攝取、有氧糖酵解和氧化應激。此外, EKO-BMDM-EV 增加了細胞 miR-142a-3p 水平, 從而降低了 CPT1A 水平并損害了受體髓系細胞中的 FAO和 OxPHOS, 傳達炎癥信號。高脂血癥小鼠輸注EKO-BMDM-EV治療會增加造血并驅動骨髓細胞和T淋巴細胞的炎癥反應。

          研究結果表明, apoE表達的喪失不會改變培養的巨噬細胞分泌EVs的速率或大小, 但它會顯著影響其細胞信號傳導特性。巨噬細胞EVs免疫代謝調節特性具有Apo依賴性特征, 受EmiR-146a-5p和miR-142a-3p控制的轉錄軸。

          實驗中巨噬細胞分泌的外泌體的分離和純化主要操作流程如下:

    1)將BMDM以5×106個細胞/板的密度接種到15cm平板中培養6-8天后, 在自帶EV耗盡的調節培養基(經Type 45 Ti轉頭100000×g超速離心18小時)中孵育24小時;

    2)收集調節培養基, 4℃下以400×g離心10分鐘以沉淀死細胞和碎片, 然后在4℃下以2000×g離心20分鐘以消除碎片和較大的囊泡;

    3)然后將上清液過濾(0.2μm),添加于60%碘沙醇(iodixanol)緩沖液之下, 用Type 45 Ti轉頭以100000×g離心3小時, 收集沉淀;

    4)重懸沉淀, 采用OptiPrep密度梯度液(5%, 10%, 20%w/v)在SW 40 Ti轉頭4℃下100000×g離心18小時進一步分離純化EVs;

    5)從管頂部開始收集不同密度餾分, 共獲得12個1mL 級分。將梯度餾分7在PBS中用Slide-A-Lyzer Mini透析裝置透析后, 用于后續細胞處理實驗和EVs表征分析。

     

    實例2:骨髓細胞EVs的CD8 + T細胞活化調節機制研究(Lisa Rausch, 2023)

          急性炎癥反應中循環磷脂酰絲氨酸陽性細胞外囊泡(PS+ EVs)與體內活化的CD8 + T細胞相互作用研究的動物實驗中, 源自BMDC的EVs也采用了先Type 45角轉頭沉淀后水平轉頭密度梯度純化的操作流程:

    純RPMI培養基以1:1比例與FCS混合后, 在4℃以100000×g離心18小時進行EV排空處理, 0.2μm過濾上清后-20℃儲存備用;

    動物股骨和脛骨骨髓細胞以1×106 / mL的密度接種在RPMI 1640培養基中培養6天后, 用30 ng/mL LPS和2 μg/mL SIINFEKL肽刺激貼壁細胞72 h后, 從BMDC收集上清液(每次實驗約70個T175瓶);

    2000×g離心20分鐘除去碎片;

    上清用0.2μm濾膜過濾, 使用45Ti型固定角轉頭4℃下100000×g離心90分鐘;

    將含EV的沉淀重懸于含有蛋白酶抑制劑的PBS中, 并使用Amicon離心柱濃縮。

    洗滌后的EVs鋪墊在超透明離心管(344062)的底部;

    用60%碘沙醇溶液覆蓋EVs液層, 另用PBS稀釋的30%碘沙醇覆蓋在60%濃度碘沙醇溶液之上, 最后用PBS覆蓋在離心管液體頂部, 完成不連續密度梯度溶液制備;

    在SW 55 Ti水平轉頭中4℃下離心160000×g離心18小時;

    從離心管梯度頂部收集每組餾分, 每種餾分各500μL。將餾分3至8合并后, 在Amicon離心柱中洗滌和濃縮;

    納米顆粒跟蹤分析(NTA)測定EVs濃度后, 按2-7×1011 EV劑量注射受試小鼠。

          上述兩項研究中, EVs分離的離心參數基本與“基礎操作流程1”基本一致, 不同之處有兩點。

          一是研究的內容, 除EVs常規表征分析外, 引入了EVs動物體內功能的驗證分析。在第一輪超速離心沉淀完成后, 將第二輪洗滌EVs去除蛋白污染速的離心沉淀調整為碘沙醇密度梯度純化, 以減少沉淀物中蛋白、其它囊泡類污染組分對體內實驗的干擾。

          二是第二輪外泌體純化操作的超速樣品管比“基礎操作流程1”常用的0.2-1.5mL微量管大。上述實例中, 同為從培養細胞分泌的EVs, 首次超速沉淀時單管體積均為94mL, 第二輪密度梯度離心所用轉頭是兩款工作容量不同的水平轉頭SW 40 Ti(6×14 mL)和SW 55 Ti(6×5.0 mL)。通常, 轉頭容量大, 密度梯度溶液可加載的EVs粗提物量更大, EVs最終產量大(SW 40 Ti采集的各餾分體積為1mL, 而SW 55 Ti產物體積為0.5mL), 既方便分離后各餾分條帶回收操作, 又方便體內實驗中EVs接種劑量的優化調節, 操作更為靈活。 

    (后續:Type 45Ti轉頭在核糖體分離中的應用

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