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  2. 百家秘籍

    從PubMed數據看Beckman超速離心機Type 45Ti轉頭的配置與應用——核糖體的分離

    前續:Type 45Ti角轉頭在細胞外囊泡離心分離中的應用 

    三、Type 45Ti轉頭在核糖體分離中的應用

           核糖體是細胞蛋白質的合成場所, 遍布于原核、真核生物的細胞質, 真核生物細胞線粒體和植物細胞葉綠體中。生長旺盛的大腸桿菌胞體內約2.0 萬個核糖體, 約占細胞總重量的1/4。真核生物細胞中的核糖體不僅數量多(為細菌內核糖體顆粒數量的50倍), 其體積更大。核糖體體積小, 直徑20-30nm, 借助于電子顯微鏡技術才實現可視化。其最早由美國洛克菲勒醫學研究所羅馬尼籍亞細胞生物學家帕拉德(G. E. Palade)發現并于1956年正式公布, 故在1958年被正式命名為核糖體(ribosome)前, 一度被稱為“帕拉德離子”。

           在帕拉德發現核糖體并發明蔗糖密度梯度超速離心分析技術后不久, 人們就認識到核糖體提取緩沖液中的鎂離子濃度的大小不同, 得到的核糖體產物不同。鎂離子濃度較高時得到的是沉降系數(sedimentation coefficient)為70S細菌完整核糖體;而鎂離子濃度降低時得到是沉降系數分別為30S 和50S的兩個大小不同的核糖體亞基。從發現核糖體到基本弄清核糖體蛋白質合成的精細結構基礎前, 用70S指代核糖體, 以50S、30S分別命名一大一小兩個亞基的做法就一直沿用至今??梢? 超速離心技術的應用在核糖體早期研究中發揮了關鍵作用。不同種屬、不同胞內定位的核糖體, 根據沉降系數的大小, 主要分為55S核糖體、70S及80S核糖體三大類。其中, 原核和類似原核細胞的70S核糖體由50 S 大亞基和30 S 小亞基組成, 真核細胞80 S 核糖體由60 S 大亞基和40 S 小亞基組成。哺乳動物細胞線粒體內55S核糖體(mitoribosome)由28S和39S兩個亞基組成。

           要討論超速離心分離核糖體, 就繞不開前人已給出的沉降系數值。

           沉降系數是人們用于描述生物大分子(如核酸、蛋白)和一些大分子復合物(如核糖體、核糖體亞基)在特定液體溶液中離心沉降速度的參數。將樣品分子視作外具有一定直徑在超速離心力作用下的運動質點。質點在離心力和浮力作用下加速運動, 離心力減去浮力為分子顆粒所受的凈離心力, 即:

    F = m·ω 2·r  ····················(1)

          樣品顆粒直徑假為d(單位:cm), 顆粒密度為σ, 顆粒自身體積為V, 溶液密度為ρ, 則質點在離心力和浮力作用下加速運動所受的凈離心力F =  V·(σ ? ρ ) ·ω 2·r  ····················(2)

          顆粒以沉降速度ν在溶液中運動, 所受的流體反向摩擦阻力為f, 根據粘性流體力學的stokes 定理有:

    f = 3π·d·η·ν  ····················(3)

          當水平方向上的凈離心力與液流摩擦阻力達到平衡時, 則顆粒以勻速在溶液中沉降。此時F = f, 即:

    F1 = V·(σ ? ρ ) ·ω 2·r = f = 3π·d·η·ν  ····················(4)

          球體體積計算公式V =  (4/3) ?π?(d/2)3 = (π/6)?d3····················(5)

          公式4和5簡化可得到顆粒在溶液中沉降速度ν的計算公式:

    ν = (d2/18) ?[(σ - ρ)/η]?ω 2·r  ····················(6)

          可見, 外形規則的球形顆粒在粘度為η、密度為ρ的溶液中勻速運動速率大小與顆粒自身、密度大小、所受離心力大小有關。

          而根據公式2、5和6, 可得到以下公式:

    ν/F =  (d2/18) ?[(σ - ρ)/η]  ····················(7)

          公式7中的ν/F, 即樣品顆粒在單位離心力作用下的勻速沉降速度。當樣品溶液條件一致時, 每單位離心力下顆粒沉降速度大小與顆粒直徑、密度有關。將顆粒在單位離心力作用下移動速度視為樣品離心運動屬性, 定義為樣品顆粒的離心沉降系數。由于顆粒直徑很小, ν/F比值一般為10-13數量級。多數生物大分子的比值在10-13至10-13量級。 因沉降系數的概念由瑞典科學西奧多·斯維德伯格(Theodor Svedberg)在1924年提出。為紀念這一超速離心技術方法創立者, 沉降系數的數量單位被規定為S。1 S = 10-13(秒)。蛋白的沉降系數在1-20S之間, 核酸的沉降系數在5-100S 之間。

          將沉降系數的概念應用于公式6后可知, 樣品的沉降速度與沉降系數、離心力大小有關。樣品溶液、轉頭及轉速條件相同的情況下, 樣品組分的沉降系數大, 則沉降速度快。

          原核生物的70S核糖體由50S大亞基及30S小亞基組成。當提取液中同時含有這三種組分時, 無論是在核糖體提取緩沖液或連續蔗糖密度梯度液中, 70S核糖體的沉降速度都將大于兩個亞基的速度。在提取緩沖液超速離心階段, 首先沉淀的是70S。延長離心時間, 則依次是50S、30S亞基沉淀。因此, 利用核糖體及各組分沉淀時間上的差異, 可在同一份樣品中將核糖體與其組成亞基分離。但同時須注意:離心時間過長, 樣品中沉降系數為50S - 70S的(囊泡類)組分發生沉淀富集, 會帶來污染。

     

    3.1 原核生物核糖體分離

    實例1. 痤瘡角質桿菌70S核糖體的制備(Ivan B Lomakin, 2023)

          核糖體基因序列盡管高度保守, 但不同菌種間存在廣泛結構差異。開發更具病原體物種特異性核糖體靶向窄譜抗菌藥物有助于避免許多靶向核糖體的抗生素大多數具有廣譜抗菌活性對人體微生物組的破壞。

          研究顯示, 在痤瘡梭菌核糖體結構中發現的核糖體蛋白bS22和bL37, 不僅確保了核糖體結構完整性, 還可以穿透細菌細胞壁并抑制蛋白質合成, 可以作為細菌素抑制革蘭氏陽性表皮鏈球菌和病原體金黃色葡萄球菌的生長。其中的bS22只抑制革蘭氏陰性大腸桿菌的生長。

          第三代四環素類窄譜抗生素沙雷環素(Sarecycline, SAR)對包括痤瘡梭菌在內的一些革蘭氏陽性細菌具有抑菌活性。但借助于冷凍電鏡研究發現, SAR可能抑制痤瘡角質桿菌70S核糖體的兩個活性位點。SAR除30S亞基中mRNA decoding center的經典抗菌結合位點外結合外, 50S亞基活性中心的第二SAR結合位點。SAR通過結合兩個的核糖體中心/活性位點, 發揮痤瘡梭菌抗菌功效和低耐藥性。因此, 通過進一步優化SAR在70S核糖體的靶位, 抑制痤瘡梭菌的同時, 發揮核糖體蛋白bS22和bL37的選擇性抑菌功效, 維持皮膚/毛囊皮脂腺單位微生物組的穩態。

          痤瘡梭菌核糖體70S制備流程大致如下:

    【細菌培養】

    在厭氧條件下生長痤瘡角質桿菌C. acnes.痤瘡梭菌細胞(ATCC 11827TM)根據ATCC指南(Microbiological CμLture Media: A Complete Guide for Pharmaceutical and Healthcare Manufacturers)在血瓊脂接觸板上重新激活和鋪板。將來自一個平板的細胞轉移到裝有2升腦心浸出液培養基(Brain Heart Infusion Broth,BHI)的6升燒瓶中, 并在搖床上37℃下100rpm振蕩培養40小時。

    【菌體裂解】

    5g菌體樣品懸浮在50mL緩沖液B中[20mM HEPES-KOH/pH 7.5, 200mM KCl, 20mM MgAc, 1mM DTT, 1 mg/mL溶菌酶, 1片Roche復合蛋白酶抑制劑(cOmplete Protease Inhibitor Cocktail)和100U的DNase I];

    用高壓均質器中以15000 psi裂解3個周期后, 用Type 45Ti轉頭4℃下18000rpm離心30 min, 收集上清;

    【超離純化】

    上清轉移至25mL蔗糖溶液(20mM HEPES-KOH, 500mM KCl, 20mM MgCL2, 1mM DTT, 1.1M sucrose)墊層上, 用Type 45Ti轉頭4℃下42000rpm離心21小時, 收集沉淀;

    沉淀重懸于高鹽緩沖液[20mM HEPES-KOH/pH 7.5, 500mM KCl, 10mM MgAc, 1mM DTT]中, 4℃下平緩振蕩孵育3小時, 重復上一步的蔗糖溶液離心操作;

    沉淀用高鹽緩沖液重懸, 轉移至蔗糖密度梯度溶液[20mM HEPES–KOH/pH 7.5, 60mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 10–40% sucrose]墊層上, 用SW 32 Ti轉頭4℃下20000rpm離心16小時;

    【濃縮保存】

    收集70S核糖體對應的密度帶餾分,用Amicon離心濃縮濾柱(100KDa MWCO)濃縮;

    將濃縮后的70S洗脫于核糖體緩沖液[20mM HEPES–KOH/pH 7.5, 60mM KCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT)中, 液氮保存。

     

    實例2 金葡菌70S核糖體的制備流程(Iskander Khusainov, 2017)

    【細菌培養】

    在腦心浸出液培養基(Brain Heart Infusion Broth,BHI)中以37℃、180rpm振蕩培養2L金葡菌RN6390, 在AD600 = 1.0 AU/mL時收獲菌體;

    用10mM Tris–HCl/pH 7.5緩沖液洗滌細胞兩次,4750×g離心沉淀細胞(典型產量是2L培養物得到4.5–5.0g濕重菌體細胞);

    【菌體裂解】

    將沉淀重懸于30mL補充有蛋白酶抑制劑混合物、DNase I和3.5mg溶葡萄球菌素的緩沖液A[20mM HEPES-KOH/pH 7.5、100mM NH4Cl、21mM Mg(OAc)2、1mM EDTA、1mM DTT]中, 37℃下裂解45min(注:裂解處理方法未載明);

    30000×g離心90min除去細胞碎片;

    在上清液中添加補充PEG 20000至最終個濃度2.8%(w/v)后, 10000×g離心5min,棄沉淀;

    將上清液中PEG 20000濃度增加到4.2%(w/v)后,20000×g離心10min,棄上清收集(核糖體)沉淀;

    【超離純化】

    沉淀重懸于35mL緩沖液A中, 并移液至25mL蔗糖緩沖液墊層[10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 500mM KCl, 25mM Mg(OAc)2, 1.1M sucrose, 0.5mM EDTA, 1mM DTT]上,用Type 45Ti轉頭4℃下158420×g下離心15小時,收集沉淀;

    將沉淀重懸于緩沖液E[10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 100mM KCl, 10mM Mg(OAc)2, 0.5mM EDTA, 1mM DTT]中。測定A260值,計算的蛋白濃度約7mg/mL。將0.5mL懸浮液移液至7–30%蔗糖密度梯度上,  用SW 28水平轉頭38694×g離心15.5小時;

    【濃縮保存】

    收集并將70S對應餾分合并后, 調節Mg(OAc)2濃度至25 mM, 加入PEG 20000至終濃度為4.5%(w/v),20000×g離心12min將核糖體沉淀(典型的產量是來自5g細胞的10-12mg核糖體);

    將沉淀溶解在緩沖液G[10mM HEPES-KOH/pH 7.5, 50mM KCl, 10mM NH4Cl, 10mM Mg(OAc)2, 1mM DTT]中至終濃度為25-30mg/mL。分為30μL的等分經液氮速凍后-80℃儲存。

     

    實例3 大腸桿菌70S核糖體的制備流程(Liang Meng Wee, 2023)

    【菌體裂解】

    收集對數生長期(OD600 = 0.5)大腸桿菌MRE600(濕重約2.4g), 重懸于15mL添加cOmplete的裂解緩沖液[20mM Tris-HCl/pH 7.5, 100mM NH4Cl, 10mM MgCl2, 0.5mM EDTA和6mM β-ME)中;

    用超聲細胞破碎儀50mL玻璃杯在冰上裂解細胞。輸出功率設置為8, 3×30秒脈沖, 30秒間隔);

    裂解液轉移至50ml Nalgene Oak Ridge管中, 在Avanti JXN-26離心機JA-20轉頭中4℃下16000rpm離心15min;

    用5mL裂解緩沖液沖洗沉淀后, 將沖洗液、上清合并后,樣品總體積約27mL;

    【超離純化】

    轉移至35mL蔗糖溶液[20mM Tris-HCl/pH 7.5, 500mM NH4Cl, 10mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 6mM β-ME, 37.7%(w/v) sucrose]墊層上(在Beckman 70mL帶蓋透明超速離心瓶中制備), 用Type 45Ti轉頭4℃下33000rpm離心22小時;

    棄上清, 將沉淀4℃下風干10min后, 重懸于2mL緩沖液[10mM Tris-OAc/pH 7.5, 60mM NH4Cl, 7.5mM Mg(OAc)2, 0.5mM EDTA, 6mM β-ME]中, 4℃孵育2小時;

    用梯度混合器(在open-top thick wall管 355642中)生成從上至下10–40% (w/v)的蔗糖連續密度梯度溶液(共6管);

    測定懸浮溶液的A260值, 計算核糖體的濃度相當于85mg/mL;

    將懸浮液再次轉移至蔗糖梯度溶液層墊上, 用SW 32 Ti轉頭4℃下22000rpm離心17小時;

    【濃縮保存】

    從管底部開始, 監測A260值, 以1.5mL/min流速收集樣品餾分;

    收集和合并含70S核糖體餾分, 用Type 45Ti轉頭4℃下45000rpm離心20小時,棄上清;

    將沉淀4℃風干10min后, 重懸于4℃梯度緩沖液中, 分成25μL等分, 液氮速凍后-80℃儲存。

     

    實例4 嗜熱鏈球菌(T. thermophilus) 70S核糖體純化和核糖體復合體重構(Alexey Rozov, 2015)

    【菌體裂解】

    所有操作均在4℃下進行。

    用1L緩沖液A(150mM MgCl2, 500mM NH4Cl, 40mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT)洗滌和重懸細胞(100g);

    重懸液中加入DNase(1U/mL)和PMSF(1μg/mL),用高壓均質器裂解菌體;

    30000×g離心30min除去菌體碎片;

    【超離純化】

    上清液轉移至1.5M 蔗糖緩沖液[1.5M sucrose, 0.68M CsCl, 150mM MgCl2, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT]墊層上, 用SW 28水平轉頭100000×g離心20小時;

    收集底部的5mL餾分, 用緩沖液B[50mM MgCl2, 150mM NH4Cl, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 0.5mM EDTA-Na2, 1mM DTT]稀釋3次, 轉移至1.8M蔗糖緩沖液[1.8M sucrose, 0.8M CsCl, 150mM MgCl2, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 1.5mM EDTA-Na 2]墊層上, 用SW 28水平轉頭100000×g離心40小時;

    收集底部4 mL緩沖液餾分, 在緩沖液B中析。將4M (NH4)2SO4溶液加入透析液并調整其終濃度至1 M;

    將透析液(按A260測定值計算,相當于核糖體500mg)移至含1M(NH4)2SO4的緩沖液C[10mM MgCl2, 400mM NaCl, 20mM Tris-HCl/pH 7.5, 0.5mM EDTA-Na 2, 1mM DTT]預平衡的200mL Toyopearl Butyl 650S蛋白純化柱上。用含0.8 M(NH4)2SO4的兩倍柱體體積的緩沖液C洗滌后,保持緩沖液C的其他組分恒定(流速6mL/min, 餾分體積12mL), 用900mL反向梯度(80-40%)的(NH4)2SO4洗脫。將(NH4)2SO4和MgCl2濃度分別調節至1 M和50 mM,在Toyopearl Butyl 650S純化柱中洗脫70S,檢測A260值收集70S核糖體峰;

    將7S核糖體洗脫液用緩沖液D[10mM Mg(OAc)2, 50mM KCl, 10mM NH4Cl, 1mM DTT, 10mM HEPES/pH 7.5]中透析后,移至用緩沖液D制備的5–20%蔗糖梯度溶液墊層上, 用SW 28水平轉頭15400rpm離心17小時;

    【濃縮保存】

    收集并合并70S核糖體峰餾分, 用Type 45Ti轉頭45000rpm超速離心過夜;

    將沉淀重懸于稀釋的緩沖液D中(5mM HEPES/pH 7.5)(分成等分在液氮中快速冷凍并-80℃儲存或進行下一步操作;

    將70S核糖體(3μM)與過量的mRNA、3-5含量的tRNA在37℃、pH 7.0緩沖液[10mM Tris-乙酸鹽、40mM KCl、7.5mM Mg(OAc)2、0.5mM DTT]中一起孵育形成核糖體復合物。

     

    3.2 真核生物細胞核糖體分離

    實例5  酵母菌核糖體的制備(Liang Meng Wee, 2021)

    【菌體裂解】

    收獲生長到指數期的YAS2488酵母細胞,在液氮中冷凍, 用研缽和研杵研磨破碎菌體;

    菌體粉末懸浮于裂解緩沖液[20mM HEPES-KOH/pH 7.4, 100mM KOAc, pH 7.6, 2.5mM Mg(OAc)2, 1 mg/ml Heparin, 2mM DTT, 0.5mM AEBSF]中,4℃下18000×g離心10min,棄沉淀;

    【超離純化】

    收集上清并轉移至1.1M蔗糖緩沖緩液[20mM HEPES-KOH/pH 7.4, 100mM KOAc, pH 7.6, 2.5mM Mg(OAc)2, 500mM KCl, 2mM DTT]墊層上, 用Type 45 Ti角轉頭39000rpm離心5小時20min;

    沉淀重懸于緩沖液[20mM HEPES-KOH, PH 7.4、50mM KCl、5mM Mg(OAc)2、0.1mM PMSF、0.1 mM benzamidine、2mM DTT]中, 轉移至10- 40%蔗糖梯度溶液墊層上, 用SW 32.1 Ti水平轉頭32000rpm 離心5小時;

    【濃縮保存】

    收集80S峰并將緩沖液交換至再結合緩沖液[3mM HEPES-KOH/pH 7.4, 6.6mM Tris-HOAc/pH 7.2), 3mM NH4Cl, 6.6mM NH4OAc, 48mM KOAc, 4mM Mg(OAc)2, 2.4mM DTT];

    純化的核糖體-80℃儲存。

     

    3.3 核糖體亞基分離

    實例6 從大腸桿菌MRE600中純化30S和50S核糖體亞基(Powers, T.,1991)

    【細菌培養】

    將含有100mg/L氨芐青霉素的500mL LB肉湯接種1ml飽和過夜培養物, 并在37℃下生長至A650 = 0.5。然后將培養物在冰上冷卻20min, 在4℃下用Sorvall GSA角轉頭8000rpm離心15min;

    【菌體裂解】

    將細胞洗滌并重懸于15mL緩沖液[50mM Tris-HCI(pH 7.6, 10mM MgCl 2 100mM NH4Cl, 6mM β-ME, 0.5mM EDTA]中,用高壓均質器18000 psi下連續兩次裂解處理;

    加入10μg的DNase I后, 用Sorvall SS34角轉頭(SS-34: 8×50 mL: Max. RCF 50228 xg/25000rpm)在4℃下15000rpm離心各15min兩次;

    【超離純化】

    裂解物中NH4C1調節至0.5 M, 在4℃下用Type 60 Ti角轉頭(8×38.5mL, Max. Speed 60000rpm)40000rp離心4小時;

    將粗核糖體沉淀洗滌并重懸于1mL緩沖液[50mM Tris-HCI/pH 7.6, 6mM MgCl2, 100mM NH4CI, 6mM β-ME]中, 轉移至同一緩沖液中制成的40mL 10-40%(W/V)蔗糖梯度溶液上,用SW 28水平轉頭4℃下20000rpm離心13小時;

    測定每個管中的A260值, 收集1mL餾分, 并合并含有70S核糖體峰餾分;

    【濃縮保存】

    將MgCl2濃度升高至10 mM, 并用緩沖液[50mM Tris-HCl(pH 7.6, 10mM MgCl2, 100mM NH4Cl, 6mM β-ME]將體積補充到1 mL;

    4℃下用Type 60 Ti角轉頭40000rpm離心13小時;

    將沉淀洗滌并重懸于250μL的緩沖液[50mM Tris-HCl(pH 7.6, 10mM MgCl2, 100mM NH4Cl, 6mM β-ME]中(通常產生4mg核糖體);

    4℃用微量離心機中離心2min后, 將核糖體等分, 在干冰/乙醇浴中快速冷凍, 并儲存在 -80℃;

    【核糖體解離】

    70S核糖體 通過1mM Mg2+低鹽緩沖液透析對Tris-polymix緩沖液進行透析, 解離出30S和50S亞基, 后在同一緩沖液中進行蔗糖梯度超速離心。

     

    實例7  50S、30S核糖體亞基的分離(Ivan B Lomakin, 2023)

    【超離純化】

    重復70S核糖體提取流程中提取操作;

    【核糖體解離】

    收集經第二輪蔗糖梯度離心后沉淀, 用解離緩沖液[20mM Tris–HCl/pH 7.4, 60mM NH4Cl, 1mM MgCl2, 0.5mM EDTA, 14mM β-ME)重懸;

    加樣在15–40%蔗糖梯度溶液 [20mM HEPES–KOH 、60mM NH4Cl、1mM MgCl2、14mM β-ME、15–40%(w/v) sucrose]頂部, 用SW 32 Ti轉頭28000rpm、4℃離心16小時;

    收集50S和30S亞基對應餾分;

    以離心濃縮器過濾操作并重復兩次。

     

    實例8 哺乳動物細胞核糖體重構(JμLia Flis, 2018)

    兔網織紅細胞制備不含內源性tRNA和mRNA的冷凍電鏡樣品。組織培養物(HEK293T)的核糖體亞基純化用于smFRET實驗(JμLia Flis, 2018)

    【細胞裂解】

    將300mL經核酸酶處理的兔網織紅細胞裂解物用50.2Ti轉子4℃下40000rpm離心3小時;

    將沉淀洗滌并重懸于緩沖液(5mM HEPES/pH 7.5, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 2mM DTT)中;

    測定溶液A260值, 計算核糖體濃度約(20mg/mL)(核糖體濃度-A260測定值轉換計算系數為:40S亞基為60 pmol/A260, 60S亞基為30 pmol/A260, 80S核糖體為20 pmol/A260);

    【核糖體解離】

    將KCl濃度調節至0.5M, 加入新鮮制備的嘌呤霉素(Puromycin;1mg/mL), 按100mg核糖體1mg嘌呤霉素比例, 將最終核糖體濃度調節至10mg/mL并保持0.5M KCl,冰上孵育30min, 再經37℃孵育15min(解離核糖體亞基);

    緩沖液分層到以10 – 30%的線性蔗糖梯度溶液中[5mM HEPES/pH 7.5、500mM KCl、5mM MgCl 2、2mM DTT], 4℃下18000rpm 的速度用SW 32 Ti水平轉頭離心18小時;

    監測A260采集各密度梯度餾分;

    40S和60S餾分峰混合并用緩沖液1:1稀釋后,用Type 45 Ti角轉頭4℃下40000rpm離心18小時, 將50mM HEPES/pH 7.4, 30mM MgCl2, 2mM DTT]核糖體沉淀;

    將核糖體沉淀重懸于緩沖液[20mM HEPES/pH 7.4, 50mM KCl, 2mM MgCl2, 1mM DTT]中,經液氮冷凍后-80℃儲存。

     

    3.4 Type 45 Ti角轉頭用于核糖體分離小結

          無論原核、真核生物細胞,核糖體的分離制備過程依稀有章可循。

    3.4.1 細胞裂解-差速離心-核糖體濃縮三步曲

          對于培養的原核、真核細胞,在細胞群處于對數生長期(即培養液OD600測定值達到0.5-1.0 AU/mL)離心收獲菌體。此時細胞分裂繁殖旺盛,胞內的核酸復制與蛋白合成處于高產期。從為數不多的報道看,視菌屬和培養條件不同,核糖體分離所用的初始培養基體積0.5 - 2L,可收獲到菌體濕重2-12g,最終核糖體產量4-12mg。

          與細胞碎片、細胞核、線粒體、微粒體、溶酶體和葉綠體比,核糖體密度較小、沉降系數小。因此,與細胞外囊泡分離類似,通過細胞沉淀-碎片雜質沉淀-核糖體沉淀步驟,用階梯式升高的差速離心方法是核糖體制備的基礎手段。

          核糖體制備的超速離心流程包括兩個基本步驟:一是Type 45 Ti角轉頭沉淀,二是SW 32 Ti、SW 28或SW 32.1 Ti水平轉頭蔗糖連續密度梯度純化。

          Type 45 Ti單管容量70-94mL,滿載情況下一次運行可離心400-550mL細胞裂解液,與Type 50.2 Ti(12×39 mL)處理處理效率相當而高于Type 70 Ti(8×38.5mL)處理通量。除主要承擔從澄清后細胞裂解液或蔗糖溶液離心中將核糖體沉淀,制備核糖體粗提物外,還被用于替代Amicon Ultra (100?kDa NMWL)過濾器,將核糖體經蔗糖連續密度梯度純化的餾分濃縮處理。Type 45 Ti采用40000-45000rpm(對應的RCFav 相當于124948-158137×g)的工作轉速時, 與分離EVs及可溶性蛋白組分時轉速相當, 但離心時間較長(以15-21小時常見)。 

    3.4.2 核糖體亞基分離

          當溶液中Mg2+濃度≥10nM核糖體處于緊密耦合狀態,而降低g2+濃度至2nM時核糖體發生解離,利用這一特點,在成功分離完整核糖體后,只需調整MgCl2濃度,即可實現在相同技術流程中選擇性制備完整核糖體或核糖體組成亞基。因此,無論是提取緩沖液 或純化用蔗糖梯度溶液,均采用10mM或更高濃度的MgCl2溶液;而30S、50S亞基分離環節中, 緩沖液中MgCl2的濃度常降低至1mM。

          完整核糖體顆粒,如原核細胞的70S核糖體,比核糖體組成小亞基(如30S、50S)的沉降系數大,沉降速度快,相同離心時間內氣遷移距離長。在制備核糖體亞基的環節中,核糖體解離亞基,如30S、50S聚集形成的密度條帶會落后于完整核糖體的條帶。同樣道理,為確保實驗效率,在核糖體亞基蔗糖密度梯度離心分離環節,可設定比分離完整核糖體時高的工資轉速,以提高亞基分離效率、提高小亞基組分的回收率。

     

    四、討論

          按文獻報道的數量統計,在Beckman立式超速離心機在役轉頭中,Type 45 Ti角轉頭是僅次于Type 70 Ti角轉頭(8×38.5ml)的高頻率使用角轉頭。

          蛋白、病毒、細胞器及納米顆粒物分離,被認為是超速離心技術的經典應用領域,在上述117例與Type 45 Ti有關的實驗報道中確已有所體現。

          當Type 45 Ti以最高轉速45000rpm運行時,其RCFav 158000×g的輸出性能,被證明是很好地適應了細胞外囊泡(EVs)、細胞核糖體及蛋白活性組分分離制備對離心力的要求。

          Type 45 Ti的單管容量高達94mL,樣品離心通量居所有現役超速工作轉頭之首。這對于從多達1-2L體積的細胞、菌體培養物中提取蛋白、EVs和核糖體,大有裨益。

          在Beckman立式超速離心機中,Type 70 Ti、Type 45 Ti和Type 50.2 Ti是報道中最常使用的三個角轉頭。與Type 45 Ti(6×94mL;45000rpm/RCFav 158000×g;k factor 133)相比,Type 50.2 Ti(12×39mL;50000rpm/RCFav 227000×g;k factor 69)的最大工作容量基本一致,而最高工作轉速、RCFav和k factor則略勝一籌。因此,就EVs、核糖體和蛋白制備而言,三者間Type 50.2 Ti的綜合效能居首無疑。

    Beckman Optima立式超速離心轉頭的實驗論文報道次數統計.jpg

          在角轉頭工作過程中,各種細胞器、可溶性蛋白組分和囊泡在強大離心力作用下向外、向下沉降。而密度相對較低的脂質組分則在溶液中向內、向上飄浮。這一原理被應用于組織細胞中脂蛋白、游離脂肪酸、脂質體等脂質組分的分離。

          上述實例中,關于脂質分離應用的報道數量微不足道。這一方面意味著Type 45Ti憑借RCFav 158000×g性能可將脂質與其它胞內活性組分完全分離的支持證據不足。同時還應看到,與Type 70 Ti(8×38.5mL,φ25×89mm;70000rpm/RCFav 361000×g,k factor 44)和Type 50.2 Ti(12×39mL,φ25×89 mm;50000rpm/RCFav 227000×g;k factor 69)比,一個顯著區別在于離心管尺寸不同。Type 45 Ti(6×94mL,φ38×102 mm;45000rpm/RCFav 158000×g;k factor 133)所用的94mL超速離心管管徑、管長均大于Type 70、Type 50.2所用的38.5mL管。脂質組分分離后,與PA材質管材內壁存在較大接觸面,會造成脂質大量吸附,不利于完整收集。反觀Type 70、Type 50.2,平均離心力大,對脂質之外其它可沉降細胞組分效能更高,且所用超速離心管的管徑小,內壁脂質可吸附面積小,樣品回收率更高。

          資料表明,無論是蛋白、核糖體或EVs制備,多數應用報道中,除Type 45Ti角轉頭外,還需根據沉淀體積選用單管容量相對較小的SW 32 Ti(6×38.5mL)、SW 28(6×38.5mL)或SW 32.1 Ti(6×17mL)等水平轉頭20000 - 32000rpm實施1-2輪密度梯度純化。特別是核糖體復合物重構應用實驗中,在完整核糖體分離基礎上,通過調整Mg 2+濃度將核糖體亞基解離后,在分離核糖體亞基過程中,盡可能去除內源性tRNA,mRNA新生肽鏈伴侶分子和肽鏈膜靶向因子等新生鏈復合物(RNCs),以制備出高品質的冷凍電鏡分析樣品。

     

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