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  2. 百家秘籍

    Open-top開口超速離心管的選擇及使用方法說明

           Open Top Tube,即無蓋敞口離心管、開頂管或開口管。這種類型離心管的無管蓋設計,管頂敞開,側壁厚度與直徑上下一致,樣品裝載和離心后條帶、沉淀的回收簡便。其簡潔的外形結構,既有利于達到樣品容量的最大化,又能與轉頭離心孔內壁緊密貼合,輕松實現高速、超速離心的功能。

           開口管有多種不同材質可選,常見的型號有透明PET、Ultra-Clear(PETG)管、PC管,半透明的PP管、PA管、PE管,以及可耐有機物腐蝕的不銹鋼離心管、鈦合金管等??钍娇煞譃楸”诠?、厚壁管、圓底管和錐形底管四種。

    Optima XPN-100 Optima MAX-XP CP100NX超速離心機Open-Top開口離心管全家福.jpg

           資料顯示,Beckman Optima XPN-100超速離心機適配的113款離心管中,60款為開口管。除連續流轉頭(Continuous-Flow Rotor)、區帶轉頭(Zonal Rotor)、Type 100 Ti(8×6 mL/100000rpm)、Type 19(6×250mL)和NVT 100(8×5.3mL/100000rpm)外,開口管適用于28個轉頭中的23款,覆蓋了絕大多數的角轉頭、近垂直轉頭和全部垂直轉頭、水平轉頭,實用工作轉速從80000rpm超速直至15000rpm高速。開口管容量范圍寬(0.9mL- 94mL),使用簡便,經濟性好,是超速離心機實驗中最常用的離心管選項。

           開口管離心工作原理與常規帶蓋熱封管、指封管及離心瓶有何區別,使用中有哪些注意事項?這還得從頭說起。

    Optima MAX-XP臺式超速離心機MLA-80角轉頭適配5.8mL厚壁管355647工作原理圖.jpg

           如圖1所示:在固定角度轉頭中的離心管與轉軸中線存在一固定夾角θ。工作時,水平方向作用于轉軸近側管壁所受離心力F可分解為垂直于離心管中軸的F1和與中軸平行的F2兩個分力。根據平面幾何定律可獲得F1、F2與F間計算關系。

           F2在同一側管壁內部產生相應應力(由于外因作用,在物體內各部分之間產生相互作用的內力,以抵抗外因的影響并試圖使物體保持和恢復原有外形狀態)。當F2強度超過管壁可耐受范圍時,管壁容易引發管壁內陷、開裂和變形。

           而F1則垂直地對管壁施加影響,使近軸側管壁有遠離轉軸、向管中軸線靠近(向管內凹陷)的位移趨勢,對管內液體產生潛在排擠(擠牙膏)效用。一旦排擠發生,會造成管內液面上升。而液面最高點位置抬升至超過與管口高度,勢必造成樣品外溢。

           開口管超速離心過程中管壁形變、樣品泄露的發生與否,由多重因素的決定。

    1)離心力

           同款離心管在同一轉頭中工作,轉速越高,則載樣外溢風險越大。以Beckman 4mL厚壁開口管(355645)為例。工作轉速為50000rpm時,Type 90Ti角轉頭RCFav為15470×g,而Type 50.4 Ti角轉頭內側離心孔RCFav是226800×g,外側離心孔RCFav則高達26900×g(RCFav的概念參考:《Optima MAX-XP超速離心機轉頭的選擇對外泌體分離效果影響的分析》)。毫無疑問,用Type 50.4 Ti轉頭的外圈離心孔離心更容易發生泄露。

           資料顯示,無蓋開口管在角轉頭中使用的工作轉速上限是150000rpm。如Optima MAX-XP臺式超速離心機MLA-150轉頭用的1.0mL厚壁PC開口管343778和CS150NX離心機S150AT角轉頭適配的1.0mL 薄壁管1PC Tube (5720411000)。

           離心管容量增大則工作轉速上限下調。如Optima MAX-XP的MLA-80角轉頭用5.8mL厚壁管(355647),其轉速上限為80000rpm。立式超離心用薄壁管容量整體較大,可支持工作轉速上限更低(如CP-100NX立式超速離心機P100AT2角轉頭用4.7PC厚壁管 5720411032的速度升限僅60000rpm)。13.5 - 45mL范圍的中等容量開口管,須降速使用以確保離心安全。

    2)開口管管壁厚薄和剛性

           薄壁管管壁剛性自持力不足,缺少管蓋支持時,抗離心力側向沖擊能力弱。

    厚壁管的管壁厚度超過1mm,自身結構剛性優于薄壁管,可支持無蓋條件下、在一定轉速與樣品容量范圍采用角轉頭心。

    常用的無蓋厚壁管用的是剛性強度好的PP和PC材質。如Type 45 Ti角轉頭適用的厚壁開口管中的4mL管(355644-PP;355645-PC)、10.5mL管(355639-PP;355629-PC)、45mL PP管(355628)和47mL PC管(355643)。

    3)轉頭傾角因素

           轉速相同、離心半徑接近情況下,轉頭傾斜角θ增大,管壁承受的F1減小,管壁對液體排擠作用相應減弱。最關鍵的是,轉頭超速運行狀態下,管內液體平面由彎月型轉變為豎直崖壁式,此時液面巔頂離管口更近(見圖2)。相同離心管液體裝填量相同情況下,所用轉頭的傾角θ小,則離心形成的液面最高點離管口邊緣近;反之,轉頭傾角θ大,則液體頂部離管口管遠,樣品外溢風險降低。

    Optima XE-90超速離心機type 70 Ti角轉頭適配38.5mL薄壁開口管344367工作示意圖.jpg

           因此,無蓋薄壁開口管采用傾角較小轉頭離心時,樣品裝填量不宜裝滿。廠商通常建議,填充體積達到管額定容量的一半或略多一點即可。而開口管加配密封蓋時,樣品可裝填至液面離管口3mm的位置。

           大部分情況下,在角轉頭中使用開口管時應帶蓋使用,除用于防止樣品的外溢,可提高樣品載量和離心效率,也是重要考慮因素。以Type 90 Ti為例,該轉頭額定容量8×13.5mL,無蓋厚壁開口管355645最大容量僅4.0mL,而加蓋薄壁開口管326814的容量則多達13.5mL,超過無蓋管有效容積3倍。

           當角轉頭的傾角從45°-35°-20°一路減小到7-8°時,角轉頭就演變成近垂直轉頭。如常用于核酸分離純化和脂蛋白飄浮分離的NVT90、NVT65轉頭便是。近垂直轉頭傾角減小的直接結果是,開口管近側管壁承受的F1猛增。當轉頭傾角更進一步變成0°時,就產生了超大離心力、超快分離效能的垂直轉頭,如VTi 90、VTi 65.1等。近垂直和垂直轉頭工作時管壁側向F1之強悍(垂直轉頭的F1=F),不僅使無蓋開口管的使用不和時宜,連加蓋薄壁管、剛性PC離心瓶都無法確保離心安全。此情形下,指封管、熱封管的選擇成為必然。

           另一方面,當角轉頭的傾角θ從45°增大至90°,角轉頭就變身為水平轉頭。此時,開口管工作受力發生了重大新變化。F2=F而F1歸詢價,垂直于管壁的離心力消失,取而代之是液體樣品傳導的離心場壓強HP、管壁軸向離心力CF。

    Beckman Optima XPN-100超速離心機開口管在SE40 Ti水平轉頭中工作時的受力情況.jpg

           如圖3所示,液體處于超速離心場下,這確保開口管的管底、側壁在離心過程中與轉頭緊貼,防止離心管發生位移。

           但樣品裝填過少時,空白處管壁缺少來自液體傳導的離心場壓強支持。薄壁管在相當于自身重力加速度十萬倍的RCF環境作用下,管壁近端與遠端間應力容易在管壁薄弱處發生內陷變形(圖3中黃色箭頭所示)。這將影響離心結束后樣品條帶的回收處置。

    因此,開口管樣品裝填量,不僅是用角轉頭離心有要求,使用水平轉頭實施密度梯度離心實驗中,同樣有嚴格要求。

           業內規定:薄壁管的樣品液量填充至彎月液面最低處與管口垂直高度相差2-3mm為止。厚壁管管壁相對堅實,裝填量可填充至管半滿以上程度。不銹鋼或鈦合金離心管,因自身結構強度足夠高,管壁不依賴于液體壓強支撐而足以安全離心,因此對其液體填充水平無強制要求。

            總之,開口管在不同類型轉頭中,對樣品載量和工作轉速的限制條件是不同的。

           實際工作中,開蓋管在水平轉頭中使用可實現最高60000rpm的工作轉速(如Beckman optima XPN-100離心機的SW 60 Ti轉頭適配的3 mL厚壁管355636和355635)。但角轉頭離心工作轉速50000rpm以上時,通常建議為開口管添置配套管帽組件(Cap Assembly)。管帽組件安裝時需將閥桿(Stem)部分插入管內后固定。金屬材質的閥桿為管口提供足夠剛性支撐的同時會占用少量液體裝填空間。此時,液體裝填應考慮留足閥桿安裝空間。

           開口管蓋帽組件的安裝使用方法,有待《開口超速離心管S-Cap加蓋密封方法的說明》等的詳解。

     

    主要參考文獻

    1. Instructions For Use MLA-80 Fixed-Angle Rotor (TL-TB-024AF)

    2. Instructions For Use SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor (L5-TB-033SE)

    3. Instruction For Use Rotors and Tubes For Beckman Coulter Preparative Ultracentrifuges (LR-IM-24AK)

     

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