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  2. 操作規程

    關于機械性刺激對果蠅的睡眠誘導研究方法

    美國托馬斯·杰斐遜大學的研究團隊通過果蠅實驗發現,習慣性在單調刺激的睡眠誘導中發揮著至關重要的作用,對反復刺激的習慣化會降低喚醒感,并通過一種常見的機制增加睡眠傾向。

    關于機械性刺激對果蠅的睡眠誘導研究

    People tend to fall asleep when gently rocked or vibrated. Experimental studies have shown that rocking promotes sleep in humans and mice. However, the mechanisms underlying the phenomenon are not well understood. A habituation model proposes that habituation, a form of non-associative learning, mediates sleep induction by monotonous stimulation. Here, we show that gentle vibration promotes sleep in Drosophila in part through habituation. Vibration-induced sleep (VIS) leads to increased homeostatic sleep credit and reduced arousability, and can be suppressed by heightened arousal or reduced GABA signaling. Multiple mechanosensory organs mediate VIS, and the magnitude of VIS depends on vibration frequency and genetic background. Sleep induction improves over successive blocks of vibration. Furthermore, training with continuous vibration does not generalize to intermittent vibration, demonstrating stimulus specificity, a characteristic of habituation. Our findings suggest that habituation plays a significant role in sleep induction by vibration.

    關于機械性刺激對果蠅的睡眠誘導研究方法:

    1、睡眠分析

    為了進行睡眠分析,將3至5天大的蒼蠅進行12小時LD或恒定光照(LL)至少3天,并在裝入試管后約2天測量基線睡眠。對于DD實驗,將蒼蠅帶到LD直至裝載,并在切換到DD后1-2天測量基線睡眠。大約將16只雄性和16只雌性放在一起,直到將它們分別裝入裝有5%蔗糖和2%瓊脂的玻璃管中。實驗均在25°C進行,果蠅在22°C飼養。在22°C監測1天以確定基線睡眠水平,在29°C監測1天以激活dTrpA1通道。使用果蠅在1分鐘的容器中收集活動數據(光束中斷) 活動監測(DAM)系統,用于測量睡眠狀態,定義為持續至少5分鐘的不活動時間(Huber等,2004)。除非特別指出使用多光束監視器,否則使用單光束監視器。對于多光束數據,“計數”設置用于檢測組合的局部,光束內運動和光束間運動,而“運動”設置僅用于檢測光束間運動。光束內運動通過從計數中減去運動來計算。使用自定義的基于MATLAB的軟件SleepLab。

    2、振動刺激的產生

    將活動監視器,監視管和包含蒼蠅的舞臺放置在模擬多管渦旋儀(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)上方約40 cm的架子上,或使用螺釘固定在揚聲器系統平臺上(圖S1 A和S6)一種)。將渦旋儀和揚聲器系統放置在光溫受控的培養箱中。對于渦旋實驗,將強度設置為3,并通過LC4光控制器控制機械刺激的持續時間和時間。對于揚聲器系統實驗,使用定制的MATLAB GUI生成任意頻率和幅度的音頻信號。DAM活動監視器牢固地固定在丙烯酸平臺上,該平臺粘貼在15英寸船用低音炮的錐體上。一臺PC將音頻信號傳送到為低音炮供電的放大器,從而驅動機械振蕩。

    3、視頻錄制和量化

    對于視頻S1將果蠅裝到含有5%蔗糖和2%瓊脂的7mm×16mm×4mm孔中。使用數碼相機錄制視頻。為了對行為進行定量視頻分析,將單個果蠅裝入裝有5%蔗糖和2%瓊脂的標準DAM監測管(65 mm x 5 mm玻璃管)中。從ZT 1開始,對振動的第一個小時和上一個基準日的相應小時的行為進行手動評分。行為分類為睡眠(不活動時間大于5分鐘),休息(不活動時間小于5分鐘和> 10 s),運動,梳理和進食。持續時間少于10 s的不活動被分類為與側翼期相同的行為。來自由兩個人獨立評分的兩個實驗的數據顯示了相同的結果模式,

    4、感官反應性分析

    果蠅在持續適度的強光(?500 lux)下被夾帶后,暴露于變化持續時間(1 s,15 s和1分鐘)的極亮光(?15,000 lux)下。使用LC4光控制器,每隔30分鐘在交替振動(1 h)和無振動(1或2 h)的過程中每隔30分鐘施加一次明亮刺激。在第一個振動周期開始后的25分鐘,開始進行一系列的光刺激。感官反應性的測量方法是:在刺激出現時在睡眠中的蒼蠅在亮光刺激后2分鐘內開始移動的百分比。在光刺激前10分鐘對數據進行類似計算,以測量自發覺醒。在振動1小時和靜音2小時的交替時間內,每小時施加一系列1分鐘的暗脈沖,在第一次振動發生后45分鐘開始。使用Excel確定在明亮或黑暗脈沖的2分鐘內喚醒的熟睡蠅的百分比。

    5、免疫組織化學

    對于整個安裝免疫染色,將雌性大腦在4%多聚甲醛(PFA)中固定60分鐘。在PBT中洗滌3次(在PBS中為0.3%Triton-X)后,將切開的腦在1%的PBT中的正常山羊血清中于室溫封閉1小時,并在4°C下與一抗孵育過夜。在PBT中洗滌3次后,將它們與二抗在4°C下孵育過夜。兔抗GFP以1:1500使用,小鼠抗BRP在1:200,Alexa Fluor 488山羊抗兔在1:1000和Cy5山羊抗小鼠(在1:1000。Leica SP8共焦顯微鏡用于圖像處理。

    6、天線消融

    使用3毫米Vannas彈簧剪刀將1至2天大的蒼蠅的所有三個觸角節段進行物理移除?;謴?天后,將蒼蠅裝入監測管進行睡眠分析。

    7、轉基因蠅系

    為了生成UAS-Gad1 shRNA構建體,按如下所述設計在Gad1的編碼區中包含兩個21聚體(GAT TGT TGA TGT CGC GTA AGC和GGG TAT AAA CTG TCC GAG AGG)的215bp,由GeneArt合成。將合成的DNA插入pUAST載體中,并通過標準的種系轉化在iso31背景下產生攜帶該構建體的轉基因系。

    8、量化與統計分析

    統計測試使用GraphPad Prism 8進行,除了以下所述的雙向重復測量方差分析。將Paired Student’s t檢驗與Bonferroni校正配對使用,以確定振動是否引起睡眠和活動的顯著變化。為了比較成對的天線對(如觸角消融蠅和完整蠅),進行了未配對的Paired Student’s t檢驗,并且為了比較3個或更多的組,進行了方差分析。如果各組的方差不相等,則使用Welch t檢驗進行方差不均或使用方差分析的Brown-Forsythe和Welsh版本。在進行方差分析后,根據事后檢驗的類型和數量,進行了Dunnett’s或Sidak’s的檢驗。進行Wilcoxon配對對帶Bonferroni校正的正負秩檢驗,以分析睡眠發作持續時間數據。為了分析亮脈沖和暗脈沖的可喚醒性,進行了χ平方檢驗,然后對多個檢驗進行了Bonferroni校正。比較連續振動和間歇振動圖5中,使用SAS v9.4執行了兩次重復測量方差分析,其中訓練塊為對象內因素,連續和間歇振動塊的順序為對象間因子。主要因素之間的所有相互作用都是顯著的,并且使用Bonferroni方法對選定的事后比較進行了多次比較的校正。統計測試的詳細信息,包括p值和n,可以在圖例中找到。所有實驗均使用獨立雜交的果蠅進行了至少兩次。

     

    關于機械性刺激對果蠅的睡眠誘導研究

    本研究所需試劑:

    多肽和重組蛋白、兔抗GFP 分子探針 、小鼠抗BRP、Alexa Fluor 488山羊抗兔、Cy5山羊抗小鼠 、16%多聚甲醛水溶液、普通山羊血清

    儀器耗材:監測系統、單束監測儀 、果蠅活動監測系統、多束監測儀、LC4燈光控制器、渦旋儀、培養箱、顯微鏡


    論文鏈接https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(20)31451-0?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124720314510%3Fshowall%3Dtrue

     

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