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  2. 操作規程

    試析NanoDrop OneC微量紫外可見光度計常規維護的必要性及要點

           賽默飛公司旗下NanoDrop One(NanoDrop One Micro volume UV-Vis Spectrophotometer)、NanoDrop OneC為代表的微量紫外可見光度計產品在分子生物學實驗中應用的大獲成功,最重要的原因就是應時而生:只需區區2μL而非20μL、50μL、100μL、500μL甚至750μL樣品,就完成了核酸的純度(A260/A280、A260/A230)和濃度(A260)的測定工作,首先從樣品體積上實現了affordable。其次,測試中無須消耗一次性紫外透射型比色皿,無須進行裝樣-測定-清洗比色皿-再重新上樣的重復操作。只需低廉、干凈的拭紙一角輕輕擦拭兩下,就可進行下一個樣品的測定,時間和經濟帳上更是affordable。
           在各種渠道和形式的宣傳中,NanoDrop系列微量紫外可見光度計儼然成了終身免校正、免維護的“國民紫外”。而對實驗者和儀器管理人員,來之即用,用后關機,維護全免,正好落個清閑!
           那事實果真如此嗎?
           NanoDrop One、NanoDrop OneC的共同工作部件有觸摸屏、檢測臂和樣品基座。此外,NanoDrop OneC配置有比色皿檢測模塊,用于完成動力學測試、OD600細胞/菌體濃度測定、GMP等規范所要求的稀釋樣品檢測等由常規紫外可見分光光度計擔負的工作。撇開觸摸屏、比色皿模塊這兩部分,NanoDrop儀器常規樣品測試中,到底有哪些不可或缺的維護規程?

    NanoDrop OneC微量紫外可見光度計測試工作面.jpg

    一、檢測基座工作面的清潔(Cleaning the Pedestals)
           檢測基座工作面包括上基座(upper pedestal,可升降的檢測機械臂接觸樣品的部分)和下基座(lower pedestal,底座上承接液樣的突起柱頭)。上下基座外圍為白色303不銹鋼材質,正中為可透射紫外的石英光學玻璃窗。

           光學窗口殘留的液體、普通擦拭用的紙巾纖維以及實驗室塵埃顆粒、化學染料附著,都直接干擾吸光度測定值。故基座的仔細清潔是必不可少的操作環節。
           基座清理分為測試樣品間隔的清潔、不同實驗樣品測定后的清潔和測定中發生樣品污染的清理。
    1.1 兩個樣品測試間隔的基座清潔
           由于NanoDrop系列儀器都是利用液體表面張力作用形成的微細液柱來測試,光路要從上基座穿透液柱進入下基座后進行檢測器。因此,清潔時應抬起儀器檢測臂,上、下基座全擦遍,而非只把下基座圓柱頭一擦了事。忽略擦拭上基座或擦拭不細致,殘留細微液珠勢必造成樣品交叉污染,失去精確測定的意義。

    NanoDrop OneC微量紫外可見光度計測試中的樣品清理.jpg

     
           清潔應使用適合于潔凈間、精密光學實驗設備用的專業無絨低塵擦拭紙(譬如金佰利公司Kimwipes小綠盒低塵擦拭紙等),而非日常生活普通清潔紙巾。 

    1.2不同用戶上機前后的基座清潔
           建議每個新用戶在第一次空白對照樣品檢測或樣品檢測前和每批樣品檢測結束后,使用去離子水(deionized water,DI H2O)或實驗室二級純水(RO反滲透水)、實驗室無塵紙,對樣品基座進行徹底清理。

           規范操作手法是:
    1)抬起檢測臂,用新的實驗室無塵紙擦拭上下基座;
    2)用移液器吸取將 3–5μL去離子水添加至下基座;
    3)降下檢測臂保持2分鐘;
    4)抬起檢測臂,用新的無塵紙擦拭上下基座。 

    1.3 污染發生后的徹底清理
           當出現樣品底座肉眼可見的殘留(如遺留在基座上的干燥樣品),需使用0.5M的稀鹽酸(HCL)按照1.2步驟進行初次清理,然后用去離子水執行1.2流程。

     

    二、檢測基座的修復(Reconditioning the Pedestals)
           NanoDrop One、NanoDrop OneC微量紫外可見光度計是利用液體表面張力作用,通過特殊樣品滯留系統(液體接觸界面),使微量液體在上、下基座間的空隙形成一個細小液柱。上基座內嵌入的光纖線纜連接氙燈光源,下基座內嵌入的線纜連接檢測器。檢測臂降下時,光從上而下通過液柱到達下底座進入檢測器,從而生成吸光度與樣品光吸收光譜數據曲線。
           拉伸光學液柱的測量技術對液體表面張力特征存在依賴。表面張力大的樣品可以正常檢測,而表面張力小,樣品容易出現液柱拉斷,使測量失效。
           已知測試樣品的溫度(溫度升高表面張力減?。?、鹽分含量(水溶液加入無機鹽后表面張力增大;而低鹽溶液,如脫鹽后的蛋白溶液,表面張力要減少)、非極性溶劑(一般指烷烴,如正己烷、庚烷、苯、甲苯等),表面活性劑/去污劑(如SDS、Triton X100、消泡劑存在的液體樣品,表面張力降低)殘留等多種因素均可顯著樣品溶液表面張力。

    NanoDrop OneC微量紫外可見光度計工作原理.jpg

           此外,與液體接觸的基座表面的疏水狀態,對液體獲得足夠大的表面張力極為關鍵。
           正常使用情況下,隨著使用時間推移,NanoDrop檢測基座的表面也可能會失去其“已調節”的屬性,特別是在使用含有異丙醇或表面活性劑(如Bradford法蛋白定量試劑)的溶液測量后(The pedestal surfaces may lose their “conditioned” properties over time, especially after measurements with isopropyl alcohol or solutions that contain surfactants or detergents such as the Bradford reagent. ),基座表面處于未調節(unconditioned)的狀態?!拔凑{節”基座會導致滴加在下基座的液滴“變平”,在檢測臂降下時阻礙正常形態液柱的形成,由此產生的光譜可能看起來顯得“粗糙”或呈“鋸齒狀”。
           因此,檢測基座需要定期維護以保持檢測的完整性。這一點適用于所有NanoDrop系列單道(如NanoDrop 1000、NanoDrop 2000/2000C、 NanoDrop One/One C、NanoDrop Lite、NanoDrop Lite Plus)、多道(NanoDrop 8000、NanoDrop Eight微量紫外可見光度計。
           無論何時,當液滴樣品在基座上呈現扁平形狀(而不是串成“微珠”或形成飽滿的圓形液滴),或液柱在檢測期間碎裂,則須立即對基座修復以恢復其表面疏水特性。

    NanoDrop OneC微量紫外可見光度計樣品基座的修復.jpg

     

    2.1 專用基座修復試劑法
           基座修復需用到無絨實驗室無塵紙、移液器(0–2.5μL)和PR-1基座修復試劑盒。PR-1 基座修復試劑是一種專門配制的調整化合物,涂抹到樣品基座工作表面以恢復其疏水狀態。
           修復基座操作步驟為:
    1)用點樣棒蘸取PR-1基座修復試劑;
    2)抬起檢測臂并保持此狀態,在上、下基座表面均勻的涂上薄薄的一層修復化合物,保持約30秒使PR-1化合物自然揮發干燥;
    3)將干凈的實驗室無塵紙折疊成合適大小,一只手支撐檢測臂避免損壞檢測臂,擦拭上下基座表面。正常情況下,無塵紙變為黑色,代表附著在基座表面的污漬被有效去除;
    4)重復步驟3,直到上下基座表面擦拭干凈為止;
    5)用洗耳球等吹掃去除殘留在基座上的任何紙屑及雜質;
    6)驗證修復效果:將1μL去離子水滴加至下基座,水珠串成“微珠”或形成一個圓形液滴,即代表基座成功復性。

     

    2.2 稀鹽酸修復法
           PR-1 基座修復化合物是修復基座最簡單的方法。如果實驗室并無PR-1試劑盒儲備,則可用HCL和去離子完成修復工作,操作步驟如下:
    1)抬起儀器檢測臂并將 3μL 0.5M HCL滴加至下基座;
    2)降下檢測臂并保持2–3分鐘;
    3)抬起檢測臂,用實驗室無塵紙擦拭上下基座;
    4)將 3μL 去離子誰滴加至下基座,以清除HCL;
    5)降下檢測臂并保持2–3分鐘;
    6)抬起檢測臂,用無塵紙擦拭上下基座;
    7)用洗耳球等吹掃去除殘留在基座上的任何紙屑雜質。

     

    參考文獻:
    NanoDrop Micro-UV/Vis Spectrophotometer User Guide (Rev. E)
    NanoDrop 微量紫外/可見光分光光度計用戶手冊 (Rev. B)
    Solvent Compatibility and Utility(Nanodrop Instruments Technical Bulletin)

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