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  2. 操作規程

    外泌體超速離心分離法基礎操作流程1 (譯稿)

    阿拉斯加科技(北京)有限公司編譯(Ver.202309)

           細胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)是指從細胞質膜(plasma membrane)上脫落或由細胞分泌的有脂質雙層膜、內部包裹有核酸、蛋白和脂質等多種生物活性大分子的囊泡微粒。按囊泡膜起源的不同,細胞外囊泡一般分為外泌體(exosome, EXO)、微囊泡(microvesicle, MV)和凋亡小體(apoptotic body, AB)3大類。微囊泡是由細胞膜直接出芽形成的細胞外囊泡,體積相對較大,直徑100 - 1000 nm之間。凋亡小體是在細胞凋亡過程中產生,由胞膜皺縮內陷、分割包裹一團胞質中DNA及細胞器后形成的囊泡,體型最大,直徑100 - 5000 nm。外泌體是胞外囊泡中體積較最小的一種,由細胞內多泡內體(multivesicular endosome, MVE)與質膜融合后通過胞吐作用釋放到細胞外,直徑30 - 150nm不等。
           可見,細胞外囊泡的來源和分子組成具有異質性。而同時,不同微小囊泡群體(如外泌體和微囊泡)在大小、內容物、膜成分等生物物理學表型上又存在一定程度的重疊,將不同亞群完全分離純化在方法學尚有困難。因此,國際細胞外囊泡協會(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)在2018年研究指南中建議,在正式學術文件中將“exosomes(外泌體)”用“small EVs (sEVs)”(小細胞外囊泡)來表述,微囊泡和凋亡體則標注為“medium EVs /large EVs” (m/lEVs)。
           細胞外囊泡充當細胞間通訊和物質交換的介質,在許多生理和病理過程中起著關鍵作用。其中,對外泌體的研究近年呈現爆發式增長態勢。但高純度和足夠數量的外泌體分離制備在技術上充滿挑戰。
           國際細胞外囊泡協會(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)2016年10月份發布的用于細胞外囊泡隔離和表征的技術的首次全球調查報告——《Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey》中顯示,條件細胞培養基是使用最廣泛(83%受訪者)的外泌體分離起始樣品材料,而超速離心則是最常用的分離方法(81%的受訪者)。

    Optima MAX-XP臺式超速離心機外泌體分離原理.jpg

            外泌體超速離心分離法基礎操作流程中文譯稿,據法國居里研究所G. Raposo、A. Clayton等2006 年在Current Protocols in Cell Biology發表的《Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids》一文中Supplement 30 unit 3.22一節內容編譯而成。為方便閱讀,對原文表格、圖片和編排等局部略有改動。

    一、細胞培養基來外泌體分離樣品離心操作流程示意圖

     細胞培養基用Optima Max-XP臺式超速離心機進行外泌體分離的基本操作流程.jpg

    二、Current Protocols in Cell Biology 2006版外泌體超速離心分離基礎流程

    Basic Protocol 1 for the exosome purification procedure based on differential ultracentrifugation

    【實驗材料】

    調節培養基(Conditioned   medium, CM)(制備方法見支持協議1步驟5)

    PBS緩沖液

    TBS緩沖液(可選)

    低溫離心機

    50mL聚丙烯離心管

    立式超速離心機(如Beckman   Optima L-XP、Optima   XPN和Optima   XE系列)、角轉頭或水平轉頭

    立式超離轉頭配套異質聚合物超速離心管或PC透明離心瓶

    微量移液器

    臺式超速離心機(如Beckman   TL-100、Optima   MAX-XP和Optima   MAX-LT)及配套轉頭

    -80℃超低溫冰箱

    【注意事項】

    所有離心都應在4℃下進行。

    如只進行生化分析(如免疫印跡、蛋白質組學、FACS分析等),離心管無菌即可,樣品非必須執行滅菌操作。

    有當外泌體的最終應用(如用于體內或體外功能檢測)須達到無菌狀態時,需使用滅菌設備處理樣品。

    須使用無菌超離心管,樣品操作在潔凈操作臺內進行。

    超離心管和管蓋消毒可用用70%乙醇浸泡、沖洗后,用無菌PBS沖洗兩次后將PBS清除干凈后密封備用。

    超速離心角轉頭的轉頭蓋同樣需經70%乙醇清洗處理后,在超凈臺無菌環境下完成裝樣和轉頭密封操作。

    操作步驟】

    【清除細胞和細胞碎片】

    這一階段用低溫高速離心機,分三次以300xg、2000×g和10000xg順序差速離心的方法,去除活細胞,死細胞和細胞碎片。操作共5個步驟,每步需將離心管中沉淀拋棄,留上清用于下一步操作。

    1.   收集經調節培養基培養的細胞,轉移至50mL尖底離心管中,300×g離心10分鐘,去除沉淀,收集上清。

    2.   上清經低溫離心機上水平轉頭2000×g離心力4℃離心20分鐘。

    3.   用移液器在距管底沉淀上方0.5cm處,小心采集上清。避免直接傾倒上清,確保上清不被沉淀顆粒污染。

    上清轉移到適合于超離心轉子多聚異構體管或PCR離心瓶中(備注:當缺少可用于50 - 100mL管10000×g離心的低溫高速離心機及相應轉子時,將該步驟轉移至超速離心機上進行;如實驗室離心條件具備,亦可直接用低溫高速離心機轉頭及配套離心管離心)。

    用防水記號筆在超速離心管底部沉淀發生一側做好沉淀物位置標記。

    4.   將理性帶標記一側朝上安裝到轉頭中,10000×g離心力4℃離心30分鐘,沉淀細胞碎片。

    【收集含外泌體組分】

    從第一階段處理所得上清中4℃超速離心沉淀,收集包含細胞外囊泡和可溶性蛋白污染物的外泌體初提物。

    5. 將步驟3離心后的上清轉移到一新超速離心管中。

    若步驟3離心后無明顯可見的顆粒出現:使用的是水平轉頭離心則顆粒必聚集在管底部。若用角轉頭處理,則沉淀位于管的記號筆標記側靠近管底部位置。

    添加   PBS填充,使所有管中樣品容積不低于管最大容量的3/4(配平以確保離心管總重量一致,下同)。

    用移液管取出上清液時,將試管保持一定角度,使沉淀始終覆蓋有上清液,液面降低至離沉淀高度0.5cm處停止移液(剩余上清廢棄處理,以避免吸入沉淀顆粒污染)。

    6. 4℃ 下100000×g離心至少 70 分鐘(1小時+10分鐘)。

    離心時間從離心力達到100000×g開始計算。

    離心時間延長至3小時不會損害外泌體。

    7. 完全去除上清,收集沉淀。

    角轉子離心后,可直接傾倒出上清。

    水平轉子離心,須用移液管除去上清,并保留沉淀上方2   mm上清(以避免損失沉淀)。

    【清洗外泌體】

    初步分離獲得的外泌體組分含有較多可溶性蛋白污染組分。此階段通過大量PBS漂洗,再經第二輪超速離心,去除可溶性蛋白污染成份。

    8. 用微量移液器在1mL PBS緩沖液中重懸沉淀,將來自同一細胞材料的所有離心管重懸液集中在一個離心管中。然后加入PBS將完全填充滿。

    這一步中可能因沉淀顆粒少而無明顯可見的顆粒。定角轉頭離心的樣品管管,在顆粒應該生成管底靠外側位置上下沖洗來重懸。水平轉頭離心時,充分沖洗管底部,以確保樣品回收率。

    9. 4℃ 下100000×g離心滿1 小時。

    10. 完全移除上清

    角轉子離心后,可直接傾倒去除上清液后,再將試管倒置并用移液器吸出管側面和管口處剩余液體,以盡可能完全除去上清液。

    視沉淀量多少而定,繼續進行步驟11a

    11a. 如形成有沉淀(沉淀體積約調節培養基初始體積的1/2000。50mL培養基對應于25μL沉淀),則加入50-100μL PBS或TBS緩沖液重懸沉淀(即外泌體成品)。

    如步驟10中沉淀最終體積超過調節培養基初始體積的1/2000或沒有可見顆粒,則進行步驟11b操作。

    11b. 外泌體樣品濃縮

    上清用臺式超速離心機TLA-100.3轉子和厚壁開口管4℃下100000×g離心1小時后,完全去除PBS上清液,所得沉淀用新鮮20-50μL PBS重懸

    【外泌體樣品保存】。

    12.將各管中樣品以PBS統一定容至100μL后 -80℃儲存。

    可有效保存1年。

    但存儲期間應避免發生反復凍融

     

    三、基礎流程1局部替代流程(Alternate Protocol of Basic Protocol 1)

    過濾替代離心消除大細胞碎片和膜

    對于某些細胞(如小鼠樹突狀細胞)來源樣品(如腦脊液),可用0.22μm過濾器一個過濾步驟替代基礎流程1中的步驟1-6操作用于除去死細胞和大細胞碎片,同時保留了液體中的微小囊泡,以便通過超離心進純化。

    這個流程局部替代方案是否可行,需使用相同體積的調節培養基、采集相同細胞、在同一時間分別用兩個流程分離外泌體后,通過比較兩種流程所得外泌體的收益率和質量方能驗證。

    材料(參見基礎流程1):

    0.22-μm過濾器滅菌裝置(如Steritop; Millipore);

    100mL - 1L玻璃瓶,無菌;

    操作方法:

    1. 通過在無菌瓶上連接真空的0.22μm過濾器對調節培養基進行除菌處理;

    2. 過濾后的上清,如不立即進行外泌體分離,則至多可在4℃下保存1周(上清4℃超過一周可能會導致一些外泌體的丟失);

    3. 余下的分離外泌體操作步驟與基礎流程中步驟8 – 12相同。

     

    四、純化外泌體中超速轉頭及工作參數設置

    Beckman Ultracentrifuge Rotor Information for Exosomes Purification

    可用機型

    超速離心轉頭

    離心管材質/容量

    10k×g時轉速

    12k×g時轉速

    100k×g時轉速

    110k×g時轉速

    立式超速離心機

    Optima XPN-100

    Optima XPN-90

    Optima XPN-80

    Optima XE-100

    Optima XE-90

    SW 41 Ti甩平轉頭

    SW 40 Ti甩平轉頭

    PA管/12mL

    7500 rpm

    8200 rpm

    24000 rpm

    25000 rpm

    SW 28 Ti甩平轉頭

    SW 32 Ti甩平轉頭

    PA管/30mL

    7500 rpm

    8200 rpm

    24000 rpm

    25000 rpm

    Type 70 Ti角轉頭

    PC瓶/22mL

    10000 rpm

    11000 rpm

    31000 rpm

    32000 rpm

    Type 45 Ti角轉頭

    PC瓶/68mL

    9000 rpm

    10000 rpm

    30000 rpm

    31000 rpm

    臺式超速離心機

    Optima MAX-XP

    Optima MAX-TL

    TLA-100.3角轉頭

    Thick-wall管/3mL

    13000 rpm

    15000 rpm

    43000 rpm

    45000 rpm

    TLA-110角轉頭

    PC瓶/5mL

    15500 rpm

    17000 rpm

    49000 rpm

    51400 rpm

     

    五、支持流程2:制備外泌體生產培養基

    外泌體通常存在于用于組織培養的血清中。為避免這些外泌體污染,用于培養細胞的調節培養基的培養基必須去除污染外泌體。

    去除血清衍生外泌體培養基有兩種選擇:

    (1)如果細胞能在無血清條件下正常生長,外泌體生產培養基可以作為基礎培養基,補充所有營養物質和抗生素(胎牛血清FBS除外);如細胞需要一些蛋白質才能存活,可添加1%(w / v)牛血清白蛋白BSA代替FBS。

    (2)如果細胞在無血清條件下不能存活,請按照此流程從含FBS的培養基中去除FBS來源的外泌體組分,以獲得排空FBS外泌體的外泌體生產培養基(predeplete the FBS-derived exosomes from FBS-containing medium)。

    材料

    含有所需營養素(例如抗生素、L-谷氨酰胺、HEPES、2-巰基乙醇、FBS)的培養基

    超速離心機和固定角度或水平吊斗轉子

    適用于超速離心機轉子的聚異構體管或聚碳酸酯瓶

    0.22   μm 過濾滅菌裝置(如密理博Steritop)

    100mL至1升玻璃瓶,無菌

    操作步驟

    1.   準備已補充所有營養素的基礎培養基,添加20% (v/v) FBS。

    2.   超速離心排空外泌體

    將培養基4℃下100000×g離心過夜(overnight)。

    新鮮細胞培養基用SW 28或SW 32甩平轉頭4℃下100000xg超速離心70分鐘,沉淀培養基內自帶外泌體顆粒。

    如使用可重復使用的離心瓶進行外泌體排空操作,則外泌體分離操作與FBS培養基排空操作的離心瓶不得混用,以避免潛在血清內體(serum endosomes)污染。

    3.   過濾除菌

    將離心瓶內上清倒入與真空泵連接的無菌0.22μm瓶頂濾器中,啟動培養基進行除菌處理。

    注意離心管中沉淀顆粒,確保它不會松動混入。

    4.   稀釋培養基

    稀釋過濾后的培養基,使FBS的最終濃度符合外泌體生產培養基的要求。

    如細胞通常在10% FBS中培養,則用1倍體積的無FBS培養基稀釋排空外泌體處理的FBS培養基。

    請勿使用純FBS進行外泌體排空操作,因純FBS粘度大,超速離心導致純FBS所攜帶的對細胞生長有利的蛋白質和細胞因子聚集沉淀。

    5.   離心排空外泌體處理并過濾除菌的培養基在4℃下保存時有效期不超過4周。因此,應在此期間完成外泌體分離實驗。

     

     

    參考資料:

    [1]Clotilde Théry, Sebastian Amigorena, Gra?a Raposo, Aled Clayton. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; Chapter 3: Unit 3.22.

    [2]Clotilde Théry, Kenneth W Witwer,£ Elena Aikawa,et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018; 7(1): 1535750.

    [3]Clotilde Théry, Sebastian Amigorena, Gra?a Raposo, Aled Clayton. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006; Chapter 3: Unit 3.22.

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